Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 141
Текст из файла (страница 141)
Такие короткие кодирующие послеловательности называют маркерными экспрессируемыми последовательностял1и (ЕЬТ, от илах ехргеззег! зециепсе !айа). С их помощью можно изучать размеры, разнообразие и транскрипционную иктивпосп экспрессируюшихся генов человека. Ьолее того, ня основе ЕЬТ можно создавать ЬТЬ и использовать их для карти!ювания и отбора ~еномных клонов, содержащих данный ген. Части шое секвенирование кДНК-клонов и обработка полученных данных полностью авгоматизированы.
Каждую новую ЕЯ сравнивают с телзи, которые уже были секвенированы, и если последовательность действительно является новой, ее вносят в базу данных по ЕЬ Е Для поиска гомологии ЕЯ с известными генами нли сел~ействами генов и для опрелеления категории„к которой относится функция представляемого ей гена, проводят дополнительные сравнения. К !995 г. было идентифицировано примерно 300 000 ЕЬТ из 300 кДНК-библиотек 37 органов и тканей. Примерно 90 000 ЕЬТ представляют собой различаюн!неся экспрессирующиеся последовательности человека, из них примерно 1О 000 соответствуют генам, роль которых в клетке извесп~а, а остальные 80 000 — еше неоткрытым генам. Клонирование генов заболеваний человека Как правило, ген конкретного заболевания человека нельзя клонировать, руководствуясь каким-то заранее составленным набором экспериментальных протоколов.
Выбор имеющихся в распоряжешии исслелователя методов и средств зависит от конкретных условий. Начало поиска гена заболевания определяется имекидейся информацией о продукте данного гена. В олних случаях генный продукт бывает хорошо известен, в других можно лишь догадываться, что он собой представляет. Наконец, для многих на- следственных заболеваний природа генного продукта вообгце неизвестна. Для каждого из этих слу ~аев разработана своя стратегия.
В целом для поиска гена заболевания существует четыре подхода: функг!ионильцое, кандидатное, позиционное и позипиошю-кандидатное картирование. Независимо от применяемого подхода утверждать, чтоданный ген ассоциирован с интересующим исследователя заболеванием, можно лишь после того, кик у больных обнаружены нуклеотидные изменения в гене, не встречающиеся в том же гене у здоровых индивилов. Внявлегдге л!утаций и генпх человека Для выявления мутаций разработан целый ряд простых и недорогих подходов, таких как анализ конформационного полиморфизма опноцепочечной ДНК (ЬЬСР, л)пд!е-а!гапд сопГоппа!юпа1 ро!упзогрп!зш), градиентный гель-электрофорез я денатурируюших условиях (РСОЕ, с!епа!цг1пя ягагйеп! ие! е!ес! горйогегйл) „гетеродуплексный анализ (НА, )зе!егог!ир!ех апа!уз(з), химическое расщепление некомплементарных сайтов (СМС, с)зепйса! пйзглагс)з с!еауаяе), тест на укороченный белок (РТТ, ргоге!и (щпсайоп !ез!). Наиболее широко среди перечисленных подхолов применяется ЬЬСР.
Суть метода состоит в следующем. Как можно большее (по возможности все) число экзонов исследуемого гена по отдельности амнлифицируют лзетодом ПЦ!', используя в качестве митрицы ДНК больных и здоровых инливидов. Каждая пара праймеров выбирается из последовательностей, фланкирующих экзон, или из его концевых участков.
Кроме того, используя ланные секвенировяния. выбирают праймеры для амплификапии 5 -области, предшествующей первому экзону гена„ 3 -области, следующей за последним экзоном, и участков, содержащих сайты сплайсинга ПЦР-продукты каждой реакции денатурируют, быстро охлаждают и разделяют с помощью электрофорези. Ьлагодиря внутрицепочечному спариванию комплементарных оснований и образованию других связей денатурированная одноцепочечная молекула ДН К принимает определенную трехмернук> конформацию, зависящую от ее нуклеотилной последовательности.
Вследствие комплементарности Лве цепи одной молекулы ДНК имеют разную нуклеотидную после- аб8 ГЛАВА 20 Р2 т Р2 | Денатурация ! ГЦР-цролук>а | Дена>урания П11Р- пролук>а !ель-злсатрофорез 1 2 довательность, а поэтому нринимак>т разну>о трехмерную конформацию и мигрируют при гель-электрофорезе с разной скоростью. В результате после разделения в геле наблюдаются две полосы, отвечающие разным комплементарным цепям, Если две молекулы ДНК, прелставляющие один и >от же р>веток гена, но полученные из разных источников, различшотся одной парой нуклеотидов, то с большой вероятностью конформации одиночных цепей таких молекул ДН К будут различаться.
Другими словами, каждая из четырех цепей будет перемещаться при гель-электрофорезе со своей скоростью (рис. 20,22). С помощью метода ЮСР можно лишь локализовать нуклеотидные изменения в определенном экзоне или специфической области гена, но не определить природу мутации; такую инс!юрмацию может дать лишь секвенирование, Метод ЮСР имеет свои ограничения: он выявляет около 90% однонуклеотидных изменений и П ЦР-продуктах длиной не более 200 и. н. Рис.
20.22. Анализ конформационного пол иморфизма олноце почечно и Д Н К (КАСР). Препараты ДНК, различающихся одной парой нуклеопщов (А! Г е> О:С), амплифицируют ПЦР-методом с использованием одинаковых праймеров (Р1, Р2). ПЦР-пролукты денатурируют и разделяют с помощью гель-злектрофореза на двух дорожках (1, 2). Расстояние, на которос перемешается одноцспочсчная молекула ДНК, зависит от ес конформации, а последняя, в свою очередь, — от нукчеотидной последовательности. Даже если ДНК различаются лици, одним нуьлсотидным сантом, одиночные цепи могут иметь разнук> конформаци>о, а следовательно, П ЦР-продукты образуют в геле нс две, а четыре полосы. Функциональное картироаиние Функциональное картирование гена начинается с определения аминокислотной последовательности белка с известной функцией, что позволяет реконструировать нуклеотидную последовательность кодируюшей области соответствующего геня (гена-мишени).
Основываясь па этих да>шых„синтезиру>от олигонуклеотидные зонды н проводят скринннг кДНК-библиотеки, полученной лля >кани. в которой данный белок присутствует в большом количестве. Если можно получить очип!еппую мРНК, с которой транслируется данный белок, то на ней как на матрице можно синтезировать полноразмерную кДНК и клонировать ее. Правильность выбора или синтеза кДНК-клона проверякп секвенировапием.
Хромосомну>о локализацию ! ена-мишени опрелеляют методом гибрилизации !и з>1о с кДН К. клоном или выбранным с его помощью геномным клоном. Для более точной локализации Гене>ячеекое заболевание Авали> еимп>омов О!бор тенбмв«ого квоив' Вил влепив яУМФР!' Выбор Рева-кмыя>ыта Выявление мутация гена-мишени можно также провести скрипинг панели монохромосомпых клеточных гибрилов, а затем и соответствуюп>ей леле>>ионной панели при помаши кДНК-клопа или отобранного геномпого клона. За>ем для определения клонов, гибридизуюшихся с данным «ДНК-клоном, проводят скрипинг космидног о контига, охватывающего хромосОмный (>айОН, в ка'п>рам лОкализОван ген-мишень. Отобранные геномпые клоны секве- 1>ируют В, используя данные о нуклеспидной последовательности кДНК, идегпифицируют экзоны, интроны и 5'-, 3 -фланкиругащие послелователь! юсти гена.
() атсутс гвие космиднога ко> пи> а, охватьпгак>ще> а район нужной хромосомы, который солержит ген-мишенгь выделяют клон с крупной вставкой, содержащей ланный район, при помаши кДНК- или гспомного зонда. Из клона с крупной вставкой получают субклоны с небольшими вставками, и проводят их скрининг при помаши кДНК- зоила. Позитивные клоны секвенируют и характеризуют ген-мишень (рис.
20.23). Опрейте>>е>вге аияйокмбяап>ов г>оайевавтзейьвооп! Рис. 20.23. Гвункциона>ыгос картирование. Иденти- фикация гена лля слу>а>1, когда известна аминокис- лотиая послсдователыюсть его продукта. Молекулярная генетика человека 40>9 Кандиг)Он!нов картирование Хотя зтот подход пе очень зффективен при картировании генов человека, в ряпе случаев оп может оказаться весьма полезным. Суть метала состоит в следующем. Анализируют симптомы генетического заболевания и на их основе пытаалси понять, какого типа белок может быть с ним ассоциирован. Затем просматривают нуклеотияныс послепователыюсти всех клонированных на настоящий момент !енов и выбирак>т ген(ы)-кандилат(ы). Основываясь па пуклеотилной послеловательности Рена-каплилата, вырабатывают ст(>ате!ик> поиска мутаций и с ее помощью пыта!Отса установить, является ли ген-канлилат искомым геном (рис. 20.24). Принимая во внимание, что геном человека сопержит очень большое число генов, а охарактеризованы лишь пекоторыс из них, не стоит упивляться, по правильный выбор гена случается не так уж часто.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
