Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 136
Текст из файла (страница 136)
Но сначала эти полиморфныс сайты нужно обнаружить. В 1980 1. Д. Ботштейн, Р. Уайт, М. Сколник и В. Дэвис (О. Во!пей!, В. ! .. 'ттЬйе, М.Н. Яго1п!сй, ((.'тгл1. Оатйь) разработали теоретические оспоны идентификации однонуклеотидных полиморфных сайтов и использования их в качестве маркеров для построения хромосомных карт человека. Смысл методологии состоит в слсдую1цем. Рсстрицирующис эндонуклсазы (рестриктазы) расщепляют ДНК в спепифических сайтах. Когда однонуклсотидная замена происходгп ннутри такого сайта, рсстриктаза перестает его расщецлггг!н но по-прежнему узнает и расщепляет интактпый сайт н другой хромосоме (рис.
20.11, А). Поскольку один из аллслей содержит сайт узнавания для данной рестриктазы, а другой — нет, то при обработке ДНК этой рестриктазой образуются фрагменты разной длины. Наличие или отсутствие полиморфного сайта рестрикции можно установить, проведя гибридизацию ДНК с зондом, строго специфичным в отношении уникального участка хромосомы. 452 ГЛАВА 20 ААТССТГ ТТАССАА АСТСС1Т ТСАССАА Замена одной пары нуклеотилов ь д 1 В Х У Зонд а + Х,У Х (Х+У) (Х+У) ЗОнд т Зонд В » ..()в)а)ВЙ)(((Я)))(()йв,*",'".-'л-..",йл:.!:;:«)Лйлл)йй(ле))вв ф' Г~~.:.::;,:,,~:",-'::,'ф~(ь~! "ч':.:,:;.'::,-::-:,':.;,!':,'::лилраллнол)нлв'-:.",",'",:,"'' Рис. 20.!1.
Использование рестрикционных сайгон в качестве генетических маркеров. + l+ Х,У Х А. Замена одной пары нуклеотидов в рес грик+l- Х, (Х+У) Х, (Х+ У) цилашом сайте приводит к тому, что рестрик(Х+У) (Х+У) таза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) н ( — ) соответственно. Б. Участок олной хромосомы, содержалций три сайта (А. ! лл В), узнаваемые одной и чой же ре- Х У стрикчвзой. Х вЂ” расстояние между сантами А и 1, У вЂ” расстояние между сайтами ! н В, Х + У— + + расстояние между сайчами А и В.
Санты А и В во всех случаях интакчны (оба +)„а сайт ! может быль как интактным (+), так и измененным(-). Если сайт! инчакген (+), то после обрабогки ДНК рестриктазой образуются Зоил!) фрагменты Х и У. Если же он изменен (-.), то ' -н;::,:", ч:.,'";:::!,;;':: ~~$)ь())((~::.".,'.:",.'.",-.'-,.',,'-."",л«)йлнл)(ф~~~о ные".",.";,'л:: обРазУетса сдщютненный фРагмент (Х + У). Ес„:„„'„::;,:;;:, -'.;:;:;;:;~':л)(лллч(чал«(гла:'::,'."'::": -!:"::-':лл)л))ах«!Ййй;::. ":::::-:::;" ли провести блот-гибридизацию по саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент Х в чом Х,У У слулае, если сайт 1 интакген (+), и фрагмент (Х (Х+У) (Х+У) + У), если он изменен ( — ). Б. Фрагменты, образующиеся посде обработки рестриктазой, и Зоилу фралменты, выявляемые при гибридизации по "' ° -;.:;«',;-;":"':.'-„:--,:;"',";«ф „'.В)(', ~(('-(У((л:"„!,':;;:;;::!:::;:::!-,"~ф ~ „'~ "((л;::н(вал,,',:,.;:,.-, Саузерну с зондом а, лля ка;кдого нч генотипов мы, образуюплиеся после обработки ресчрикта+ Х У Х У зой„и фрагменты, выявляемые при гибрилиза- (Х+У) (Х+ У) цни с зоилом () юли Т.
Молекулярная генетика ~еловека 453 Предполжим, например, что какой-то участок хромосомы содержит три сайта, распознаваемых рестриктазой Н)пг)Ш (рис. 20.11, Ь), при этом у всех индивидуумов сайты А и В иитактны. Зто означает, что в популяции нет альтернативных аллелей по этим сайтам, т. е. отсутствует полиморфизм. В отличие от этого в сайте 1 с высокой частотой встречается однонуклеотидная замена, в результате чего он становится устойчивым к расщеплению УХЛ|г)Ш. Таким образом, две хромосомы в популяиии различаются ио данному сайту: одна из них расщепляется (+), а другая нет ( — ).
Если расстояния от са!гга А до сайта 1 и от сайта 1 до сайта В ие совпадают, каждое из них не превышает 20 т. п. н. и существует одиокопийный зонд, гибридизук>щийся с участком ДНК между сайтамн А и 1 (рис. 20.11, о)„то после блот-гибридизации по Саузерну и разделения в агарозиом геле фрагментов ДНК, полученных в результате обработки В!пг)Ш, мы сможем различить две ситуации. Первая — сайт 1 расщепляется, в результате чего образуется два фрагмента, и зонд гибрилизуется с тем из них, который ограничивается сайтами А и 1. Вторая — сайт 1 не расщепляется н зонд гибридизуется с фрагментом ДНК, ограниченным сайтами А и В (рис.
20.11, Б). Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречах)тся парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/ —, — / — ) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке 1 можно использовать зонды, гибридизуюигиеся с другими участками ДН К между сайзами А и В (рис. 20.11, У). Феномен, состоягций в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикциониого сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК„называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. Генетический статус каждого ПДРФ-покуса на одной хромосоме называют гаилотипом. В случае одного сайта существуют два возможных гаилотипа (+ илн — ), в случае двух разных сайтов — четыре (+ +, + —, — ч и — — ); для п покусов число гаплотигюв равно 2". Определение аллелей ПДРФ-покуса (или любых других полиморфных локусов), присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется гаплотипированием (генотипироваиием, ДНК- типированием).
Наследование ПДРФ-покусов происходит в соответствии с законами Менделя, и можно проследить их передачу в пределах родословной. Если изучается наследование двух и более ПДРФ-локусов в данной семье, то можно выявить рекомбинацию. На рис. 20.12 представлена следующая ситуация: отец П-!) гетерозипы ген по трем разным ПДРФ-локусам, расположенным на одной хромосоме, а у матери (1-2) сайты рестрикции в трех рассматриваемых локусах отсутствуют. Генетический витус хромосомы, унаследованной от отца каждым из детей, можно установить путем геиотипирования. Сын П-2 получил от отца хромосому, в которой произошел кроссннговер; остальные дети унаследовали от него нерекомбннантные хромосомы. На практике ДНК каждого индивидуума в отдельной пробирке обрабатывают различными Локуо А Локуо В Локуо С Локусл + у в+ Локуо С + Ряе.
20.!2. Выявление сегрегации н рекомбинации ПЛРФ-локусов в родословной. Знаками плюс (+) и минус ( — ) обозначены аллели, содержащие интактные и измененные святы рестрикиии, трех ПДРФ-локусов (А, В, С), расположенных на одной хромосоме. ! снетический сгатус 1-1 определен исходя нз генотипов его родителей, ++э/+-г. ь и — — / — — (не показаны). Определение гаплотипов у детей показывает, что !1-2 получил оз 1-1 Рекомбнпантную хромосому, а П-1 и П-3 — нерекомбннантные. Вертикальная черта, разделяющая наборы ПДРФ-аллелей под символом, обозначающим кажлого члена семьи, разделяет |омологичные хромосомы.
454 ГЛАВА 20 САСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСА стстстстстстстстстстстстстстстстстстстстстстстст Ряс. 20.13. Динухлеотялный тандемный повтор (СА)ее содержащий 24 повторяющихся элемента. рестриктазами, а затем гибридизуют с клонированными однокопийными фрагментами ДНК, которые используются в качестве зондов для выявления ПДРФ. Гибридизация ДНК-зонда с препаратом метафазных хромосом человека, распластанных на предметном стекле (гибридизация 1п з11ц), позволяет определить, соответствует ли данный зонд уникальному участку хромосомы (однокопийной ДНК). Для обозначения тыслч ПДРФ-локусов разработана стандартная номенклатура.
Например, запись (321818 соответствует локусу, идентифицированному с помощью ДНК-зонда Д3), который гибридизуется с хромосомой 21 (21), представлен одной копией (8) и зарегистрирова~ ~ Комитетом по систематизации карт сцепления человека ДЭНА Согппййее о( 1)те 1п1егпайопа! 8уа1сш Гог Нцгпап (лпха8е Мара— 1Я М) пол восемнадцатым номером (18).
Полиморфные маркерные сайты, расположенные вну~ри известных генов„обозначают по названию гена. Например, 4Рй — это полиморфный локус в гене алкогольдегидрогеназы (АР)П). Никакого стандартного обозначения для ПДРФ-аллелей нс существует. В одних лабораториях анели нумеруют по порядку (Е)!834*1, Г)!843*2 и т. д.), в других — по длине фрагмента (в т.п.н.), образующегося при наличии или в отсугствие сайта (сай.юв) рестрикции (П4856*8, (34856*12, Г)4856"4 и т.
д.). Уже идентифицированы тысячи ПДРФ- локусов, благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований. Сцепление между ПДРФ-локусом (локусами) и геном того или иного заболевания можно установить, подсчитав «парный» («двухлокусный») лод-балл для гаплотипированных семей, в которых выявлены случаи изучаемого генетического заболевания.
Аналогично, сцепление между ПДРФ-локусами можно обнаружить, проанализировав данные цо родословным, представленным несколькими поколениями. Использование ПДРФ для картирования имеет несколько ограничений. Эти локусы распределены по хромосомам неравномерно, зонды в виде клонов поддерживать неудобно, а гаплотипирование большого числа индивидов из нескольких семей методом блот-гибридизации по Саузерну весьма трудоемко.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
