Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 131
Текст из файла (страница 131)
Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц, и тем не менее применение ретровирусных векторов в качестве»поставщиков» чужеродных генов животным, которые затем могут использоваться в шццу, неизбежно вызывает вопросы относительно безопасности такоп5 подхода.
Кроме т.ого, размер трансгена, который может быть введен в орп1- низм реципиента в составе ретровирусного вектора, нс превышает -8 т. п. и., а в некоторых случаях интеграция в исходный сайт нестабильна. Все это заставило исследователей искать альтернативные способы трансгеноза. Никаких специфичных для птиц ЕЯ-клеток не обнаружено, пожгол1у подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Ьолсс перспективным представляется метод с использованием рекомбинантных эмбриональных клеток. Он состоит н следующем. Вьшеляют клетки блястодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помо1цью катионных лицидов (лицосом), связанных с грянс1еннОЙ ДНК (линосОМ1ия трансфск11ия), и повторно вводят н нодзародышевую область свежеотложенных яиц (рис.
19.!4). Часть потомков будет нести в каком-то небольшом количестве клетки донора: таких животных называют химерами. У некоторых хил|ер клетки, произошедлие от трансфипированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных животных. Чтобы увеличи.1ь вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках зародьш1сной линии, число донорских «легок н химерах можно увеличить облучением эмбрионов реципиента перед введением в них трансфицированных клеток (540 — 660 рал н течение 1 ч). Под лейстнием облучения нскогорые (но нс все) к:тетки бластодсрмы погибнут, и соотношение между трансфицированными клсткалги и клетками репиписнта увеличится н полыу первых.
По-видимому, таким образол1 можно полу 1ать трянсгснных цыплят, хот5! и с малОй эффск!инно стью. Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих порол — для придания им (ш ч(чо) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызываемым кокцилиями, повышения эффективности усвоения пзпци, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, поньппения качества мяса. Выло предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источника белковых пролуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрессия трансгсна в клетках репродуктивного нуги курицы, где обычно секрстируется большое количество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового продукта в яйце, откуда его можно затем выделить.
Трянсгенные рыбы По мсрс истощения природных рыбных запасон все болыпую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных услониях. Основная цель исслслований в этой области — созлание рекомбинантных рыб 11утем трансгеноза. До настоящего времени трансгсны вводили микроинъскцией ДНК или электропорацисй оплодотворенных яйцсклеток различных видов рыб — карпа, зубатки, форели, лосося и т. д.
Поскольку у рыб пронуклеус в оплопотворснной яйцсклсткс плохо различим н обычныи микроскоп, линеаризованную трансгенную ДНК вводят в цитоплязму онлодо1ворснных яйцеклсток или клеток эл1брионов, достиппих стадии <стырсх бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает н водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необхо51ил1ости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока„от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 1О до 70%. Трансгсн можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов заролышей, либо суммарной ДНК.
Скрещивая трансгснных рыб, можно вывести трансгенные линии. Большинство первых исслслований в этой области было направлено на исследование влияния трансгена гормона роста на скорость роста В одном из экспериментов в яйцск1етки ат- ЗАКЛЮЧЕНИЕ ЛИТЕРАТУРА лантического лосося был введен трансгсн, состоящий из следующих элементов: промотора гена антифризного белка американской бел ьдюги, кДНК гормона роста лосося, сигналов терминации/г>олиаденилирования 3 -конца гена антифризного белка американской бсльлк>ги. Как правило, трансгснные лососи бьии крупнее и быстрее прибавляли в весе, чем контрольные нетрансформированные особи. В этом случае была выбрана система экспрессии с ускоренной транскрипцией гена гормона роста в холодной воде и приголная для «всех рыб», что позволяло избежать биологической несовместимости, которая могла бы возник>>уть, если бы ген гормона роста происходил не из рыб.
Годовалые транс- генные особи, полученные в результате введения в яицеклетки нерки генетической конструкции гормона роста, подход>пцсй для «всех лососей», весили примерно в 11 раз больше, чем нстрансгенныс. Физиологическая активность линий таких трансгенных лососей в естественных условиях вызывает значительный интерес. Прелполагаегся, что в будущем гены устойчивости к болезням и стрессовым воздействием, а глк>ке гены, обуславливающие другис биологические особенности, будут введены как рыбам умеренных широт, так и тропическим рыбам.
Генетическая модификация животных при помаши технологии рекомбинантных ДИК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появивш ихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгснных животных.
Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенну>о яйцсклетку мыши с помощью микроиньекции, импла>пировали се в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцсклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбрионалы>ых Траисгснные животиыс 439 стволовых клеток и трансфскции их кгонированным геном. При этом вводимая конструкция должна интегрироваться в > сном стволовых клеток. Клетки, несушис ген-мишень в определенном хромосомном сайго, отбирают и культивируют, а затем вводят их в мьшшные эмбрионы на ранних стадиях развития.
Мышиные эмбриональные стволовыс клетки плюрипотснтны (тотипотентны), т. е. могут дать начало клеткам лк>бого типа, в том числе и клеткам заролышевой линии. Для трансгеноза используют также искусственные дрожжевые хромосомы (УАС) „ нссущис множество генов. Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения генетических болезней человека (например, болезни Альцгеймера). С помощьк> аналогичных экспериментальных подходов были получены трансгенныс коровы, овцы, свиньи, птицы и рыбы. Есть надежда, что траисгеноз позволит улучшать генотип существую>цих пород домашнего скота и выводить породы животных с новыми признаками.
Кроме того, возможно, таких домашних животных, как коровы, овцы и козы, удастся использовагп в качестве своеобразных «биологических фабрик» для получения продуктов клопированных генов. секрстируемых в молоко. Вппвгег К. Е., К. М. Айеп, К. К. Вейппйег, К. Е. Ое!!пав, К. В. Ра1в1!ег. !988. !п>гопв >псгеаве ггапвспрйопа! ейк>епсу >и ггапвйепк гп(се. Ргас. Л>аИ. Асагь Ьсй ЮоА 85: 836 — 840. С(!гоп М., В. >«'евгаг«ау, '««'.
Иа, С. Саг1воп, Т. В(еЬК О. ! ехевйпе, К. Лойпвоп-%под, М. 1.ее, Р. Вепйег(, А. ВаИв, В. КЬо!одепко, К МоИсг, К. ЯЬегг!пй!оп, В. Ре>ту, Н. 1'ао, К. В!гоше, !. 1йеЬегЬпгй, Л. Копппепв, Я. Кпп, В. ЯсйепЬ, Р. Ргавег, Р. В!. 6еогйе Нув)ор, В. Л. Яе!кое. 1997. Мц1ап! ргевсп11(пв о(' АЫ>еппсг'в гйвеаве (псгеаве ргоопсг!оп о1 42- гевЫцс а>пу!оп! )3-ргоге»г >п Ьо!Ь !гапв(сс(е>) сейв апд >гапвйсп(с тке. >«аь >)гед. 3: 67 — 72.
С1агй А. Л. 1996. С>спейс >погйбсайоп оГ ш>18 ргоге>пв. А>к Л. С1>яь Юшг. 63: 6338 — 6388. 440 ГЛАВА 19 Равай Я., Н. Ян, )н). Р. Лау, Р. Ътт. ВвйосЫ 1996. )тпртонсд нтоо) ртодисйоп ш тгапв8сшс яЬсср ехргсззтп8 )пвстйп-И)се 8готн)Ь Гас!от ! . В)о/Тсс)тло)тт8у 14: ) 85 — 188. Рен)тп К. Н., Т. Ъ'. Ъеза)ст, С.
А. В!а81, Е. М. Ропа1двоп, Р. Ятнапвап, Ън'.-К. СЬап. 1994. Ехттаотйпату ва)пюп Вгонт)Ь. Ааптге 371: 209-210. Р!авопд 1.. Е., К. К. МсСнггу, М. Л. Магйи, $. В. МсС)ейап, Е. К. О)дЬав, Л. 1 Р)ат), Л. $. Еойап. 1996. СЬатастепхайоп оГттапв8ешс рт8з схргекз)п8 Гипстюпайу аст)нс Ьлпап СР59 оп сагйас сидо)Ьейшп.
Тгалзр)алга!)ол 61: 124)-!249. 1ИТиШо Р., Я. Н. СЬеп8, Л. МагкЬай, К. Л. бгейогУ. К. ЕЬегт, Н. М. Меаде, А. Е. Впнйи 1992. Ртодис)1оп оГ сук!!с ИЬтовв тгапвшсшЬгапе сопдистапсе тс8и1атог ш тЬс шй)с оГ тгапз8сшс тике. В)о/Хес)тло)о8у 10: 74--77. НяЬвйд Р. М., В. 1, О'Роппсй, Т. ВепйоесЬеа, Р. Ъ'. Нвдзоп, К НагдЬт8, В. 1,. ВсгпЬап), Р. Лопея, К. М. Кау, К. М. Н)88)пв, Б. К.
БсЬгавв, )Ч. 1.опЬег8. ! 996. Н)8!т-ан)д!ту Ьшпап 18бх пюпос!опа) апИЬосИсз Ггош а панс! в!пни оГ пипйосиз ттапз8сшс то)се. А!а!. В)отсс)тло!. 14: 845 — 851. Родит Ън'. 1, В. 1,. ЪЪтййавв, 1..А. Ма!Ы, Л.А. Мадп', Я. А. Кай!пя, Л. Ъй'. Кп!8Ы, Ън'. Ъте)апдег, Я. Р. Яс)вЫ!о.
!994. Ехргевяоп оГ а Гипсйопа! Ьшпап сатир)ешсп! тпЫЬттот тп а тгапз8ешс р)8 ав а глоде! Гог Гбс ргснспИоп о1'хепо8спстс Ьуретаситс от8ап тс)есйоти Ргос. Атас!. Асад. Вс!. РВА 91: 11153-11157. ба!лез Р., Р. Адапь, К. В. А)евзапдпн), К. ВагЬовг, Р. Вег)йе)с!!е, С. В)ас1стней, Т. Сагг, Л. С)евепя, Т. Ропайзоп, Р. бй)езр)е, Т. бвдо, $.
Найор!ап, К. ЛоЬпвап-%иод, К. КЬап, М. ).ес, Р. Ес)Ьотнйх, 1. 1ЛеЬегЬнгй, Я. ЕИ!!е, Е. МавйаЬ, 1,. МсСап)айне, М. Моп!оуа-Хана)а, 1., Мвс)се, 1,. Райавп), Е. Реппнпап, М. Ротнег, Р. ЯсЬепЬ, Р. ЯенЬег), В. Впудег, Е. копана, Н. Тап, Л. Е!!а)е, Б. ЪнадвтнопЬ, В. Ъно)ах!п, Л. ХЬао. 1995. А1хЬеипет-туре псигоратЬо!о8у ш тгапзВспк тп!се онстелртевз)п8 Ъ'717Г )3-ашу1оЫ ргесигзог рготе)п. )нсттаге 373! 523 — 527. бапй Х., С.
1,. Нетн. 1995. Ттапз8епк ИзЬ )и ас)иасийите апд денс)ортпспта! Ью1о8у. Сигг. Тор. Рек Вто!. 30: 177 — 2)4. Нз!ао К., Р. СЬартпап, Я. )лй!яеп, С. ЕсЬвап, Ъ'. Напйауа, Б. т'онп)с!п, Р. Ътапй, б. Со1е. 1996. Сот!с)а!)нс тпспюту с1ейс)В, А)) с!енатюп, апс1 атиу)оЫ р)ас)исв )и тгапв8ешс тшсс. Воелсе 274! 99 — 102. НиврЬпез М. М., Р. Капсонг), б..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
