Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 126
Текст из файла (страница 126)
Кроче того, введенная ДНК может интегрировать в люрюе место в геноме, и зачастую множество ее копий включаются в один сайт. И наконеп, не все трансгенные мышата будут облалать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайзв интеграции, а в организме других число копий чужеродного гена может оказаться слишком большим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологических процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроиньекций используют для получения линий чышей, несущих функциональные трансгены. довольно часто. Использовинпе мог)и4пцароваппых гьябрпопильных стволовых клеток Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на сталин бластоцисты, могут нролифсрировать в культуре, сохраняя способность к дифференпировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародьплевой линии, при введении в лругой эмбрион па стадии бласгоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ЕБ) Е8-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности.
Например, в опрелеленный сайт несущественного гена в их реноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и испольювать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроин ьекций и резровирусных векторных систем. При трансфекции Еб-клеток в культуре вектором, предназначенным для инте1рации в специфический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДН К встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ЕВ-клеток интеграции вообще не происходит.
Для увеличения числа клеток первого типа используют так называемую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции клеток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт, Сайт-мишень должен находиться в такой области геном ной ДИК, которая не кодирует важных белков, чтобы интеграция чужеродной ДН К не повлияла на процессы развития или клеточные функции.
Кроме топь существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансляцию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно. Вектор для позитивно-негативной селекции обычно содержит слелуюшие элементы: 1) два блока послсловательностей (НВ1 и Н В2), гомо- логичных отлельным участкам сайта-мишсни; 2) трансген (ТС1), кодирующий новую функцию реципиента; 3) последовательность, кодирующую устойчивость к соединению С'-418 (Хео'); 4) два разных гена тимидинкиназы (Ж 7 и Г»2) вируса простого герпеса типов ! и 2 (НЕЧ-гк1 и Н8Ч-Ж2) (рис. 19.5, Л). Ключевым для позитивно-негативной селекции является взаимное расположение этих элементов.
Трансген и ген устойчивости к С)-418 (Хео") должны находиться между двумя участками ДНК, гочологичными свиту-мишени, а гены НВЧ-Ж! и НВЧ-й2 — по бокам этой конструкции. Если встраивание происходит в случайный сайт (нс в НВ1 и Н В2), то с высокой вероятностью вместе с лругими последовательностями интегрируют один или оба гена НВЧ-Ж (рис. 19.5, Л). Напротив, если инте- !рация происходит в резульгате гомологячной рекомбинации путем двоино1о кроссишовера в нужный сайт, то в геном встроятся только трансген и ген 1х1ео', а гены НВЧ-гк — нет (рис.
19.5, Б). При выращивании трансфнпированных клеток в присутствии С-418 клетки, не несущие ген 1чео', расти не будут. Выживут только клетки, в которых произошла интеграиия— иными словами, осуществляется позитивная селекция. Если одновременно с ()-418 в среду Культивирование Тра~юг«и Траисфскцня Донорняя бласгоцисч а ю!ечочпая масса Рецнпиентиая бласчоцяста Имплаппщия Трансгенное животное-основан..ль Рис. 19.4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых (ЕБ1 клеток.
ЕБ-клетки получают из внутренней клеточной массы бласчюцисты мыши. Их трансфицируют векчюром, несущим трансген, культнвирукп и иденгифнцирукп трансфипированные клетки методом позичивно-негативной селекпии или ППР. Популяцию чрансфнцированных клеток вновь культивируют и вводят в блаьтоцисты, которые затем и мпла нтируют в матку «суррогатных» матерей. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в кчстках зародышевой линии, можно получип линии трансгснных мышей.
Трансгенные животные 423 © са клетки ® Да: Обогащение чрапсфнпироваппыми ~ ЕБ-юкчяямн ~ ® у ~~$ ~~. ~®. ~~ф ® Мнкроинъекцпя в бластоцнсту 424 ГЛАВА !9 Вектор ьИ НВ! ЬЧео' ТС НВ2 г12 ромосома | Неспецифическая люстрация Вектор Гя! НВ Ь ЬЬЕО' Тй НВ2 Ж2 Хромосома | Гомсяогячная рекомбинация Рис. 19.5. Позитивно-негативная селекция. А. Неспецифическая интеграция. В хромосому встроились оба гена тимидиикиназы (гИ и гьг2), два участка ДНК„гомологнчные специфичным последовательностям хромосомной ДНК репипиентных клеток (НВ! и НВ2), ген ()Чео'), обеспечивающий усгойчивость к цитотоксическому соединению О-418, и трансгеи (ТО). После трансфеюьии проводят тестирование клеюк на устойчивость к С-4! 8 и шнцикловиру, кшорый становится цититоксичным лля клеток, синтезирующих тимидинкиназу.
Интеграция может произой пь и по-другому, со встраиванием в хромосому только гена тимиаинкиназы. В присутствии О-418 и пьнцикловира все такие клетки тоже погибают. Б'. Специфическая интеграция с помощью гомолопьчной рекомбинации. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками (НВ ! и НВ2) векторной и хромосомной ДНК в последи юьо встраивается фрагмент, не содержащий генов тимидинкиназы (гх У и г/с2). В присутствии ОмН 8 и ганиикловира выживавп только клетки, в которых прошла гомолопьчная рекомбинаиия. добавить ганцикловир, то рост клеток, синтезирующих тимидинкиназу, будет подавлен, поскольку этот фермент катализирует превращение ганцикловира в токсичьсое соединение, летальное для клетки, т. е.
произойдет негпивная селекция. Кдетки, прошедшие через такое двойное сито, скорее всего будуг содержать последовательностаь встроившуюся в нужный сайт. Хоть этот метод не застрахован от ошибок, он позволяет обогатить клеточную популяцию клетками, несущими трансген в специфичном хромосомном сайте. Более простой способ идентификации ЕВ- клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на использовании П ЦР. В этом случае ДН К- вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны зрансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствукзщей в геноме мьппи (рис.
19.6). После трансфекции ЕЬ-клеток этим вектором проводят скриниш трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р!) комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) нуклеотндной последовательности интегрировавшепз вектора, а второй (Р2) — участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных у ьастков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт Трансгенные животные 425 Вектор НВ! НЗ ТП НВ2 / Вектор нш нз тп нвз / Хромосома рома«она | Неси«пифия«окая и~п«грация Гомояогичняя рекомбнняиия Фрягм«ю н«си>везиру«тся ЛиплиФиципояянняя днк Фрагмент иуж|юго рази«ра Рис.
19.6. ИдентиФикация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплнфикации нс образуется. Р! гибридизуется с уникальным участком ((3Я) встроенной ДНК, отсутствувллим в хромосомной ДНК клетки-реципиента. Е В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ! и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы СЯ и СЯ2„с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга.
В ходе П ЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно илснтифицировать при помощи гель-злектрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансгсн (ТО), нахолящийся межлу гомоло~ич ными участками (Н В1 и НВ2), встроился в опрелеленный сант хромосомы. ожидаемый продукт амплификацин образовываться не будет (рис.
19.6, Л), а при сайт-специфической интеграции в результате ПЦР-амплификаиии образуется фрагмент ДНК извесгного размера (рис. 19.6, Б). Таким образом можно идентифицировать пулы Еб-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а пересевая клетки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой. Еб-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать такие эмбрионы в матку псевдобеременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически молнфицированные ЕВ- клетки участвовали в образовании клеток зародышевой линии, могут дать начало грансгенным линиям.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
