Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 130

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 130)

Трансгеноз крупного рогатого скота — это весьма перспективный гюдход, но создание большого числа трансгснных животных потребует времени, ведь лля того чтобы вырастить половозрелое животное из оплодотворенной яйцеклетки, нужно примерно 2 гола. Весьма актуально создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным н вирусным инфекциям и иаразитарным инвазням. Известно о суп1ествовании порол с наследственной устойчивостью к бактериальным инфекционным заболеваниям — маститу (коровы), дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица).

Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать несущих его трансгснных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболеваниями домашних животных используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тщательное наблюдение. Стоимость всех этих мероприятий может достигать 20% обшей сюимости конечной продукции. Дло выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов.

С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственныс за работу иммунной системы: гены основного комплекса гнстосовмсстимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболсс обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты„полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодируюших Н- и ) -цеин какого-либо моноклонального антитела. Идея этою подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наслелуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помошью прививок.

Введение в организм реципиента генов антител, которые связываются со специфическими антигснамн, было названо иммунизацией )п у1уо. Для это~о гены Н- и Е-цепсй иммуноглобулииов моноклонального мыши- Трацсгенные животные 435 ного антитела к антителу, связываюп2емуся с 4-гидрокси-3-нитрофенилацетатом„вводили с помощью микроинъекций в оплодотворс~ ~ ные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгснных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонал ьного антитела.

Однако количество мое!окзгональных антитсл, сОдсржаших цспи Н и Е, было невелико. Чтобы установитзь можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгснные конструкции. Трвнсгенныс овцы, козы и свиньи Тибвзца !й2. Трансзсцныс конструкции, содержащие гены человека поц контролем иромозпров, специфичных для молочных желез, и рсциписнтпис организмы трвввгев Ирвмвтвр Реввввввт ! вн белка сыворотки Г'вн р-лвктогвсбулвнв Ген б швктвглсбуливв Гвц белка выворякв Г азг Гвн цзпквзввнв Гвв р-квзввнв Ген р-казвина Ген вктиввгврв влвзминцшцв длвз.вльного двйшвив Гвнагвнтитрицсина Гвн 4икюра!Х системы сверх ывавмххви крови ! ец рввтворимого белка О04 Ген ввктабжррвнв ! Сн урокинвзы Гвв СН1К Кхззв Овца Овца Мышь Корова Мышь Мышь Кролик Гев интервсйквнв-2 Опыты зю трансгенозу в случае овец и коз в основном были направлены на превращение молочных желез этих животных в свособразныс биорсакторы для получения белковых продуктов, использующихся в медицине.

Несмотря на то что надои у овец и коз меныпс, чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода, аналогичного используемому для создания трансгснных мышей и трансгепных конструкций, содержащих гены человека под контролем промоторов, специфичных для молочных желез (табл. 19.2), были созданы трансгенные овца и коза, в молоко которых сскретировались белки человека. Они были гликозилнрованы и обладали активностью, близкой к таковой соответствующих белков, получасзиых от человека. Однако, для того чтобы убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны до|юлпительные исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз нс оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемос потомство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычего гормона роста гюд контролем промотора металлотионенна неблагоприягныс эффекты наблюдались.

Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменыпснис подвижности суставов, предрааюложснность к пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны.

Возможно, они связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтсзироватся более или менее непрерывно. были созданы также трансгснныс овцы с повьппенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего ннсулиноподобного фактора роста ! была помещена под контроль мышиного пролютора гена кератина с высоким содержанием ссрьп что обеспечивало гиперэкспрсссию кДНК. При этом у трансгенных овец в отличие от свиней никаких нежелательных побочных эффектов не наблюдалось.

Положитсльныс результаты были получены и в холе экспериментов с т рансгенными с виньями. Например, были созданы здоровые трансгснные свиньи, в гсноме которых присутствовала следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена р-глобнна человека, два гена а -глобина человека и олин ген 1ул-глобина человека. В резулшате ес экспрессии в клетках крови свиней синтсзировался чсловсчс- 436 ГЛАВА 19 ский гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена )3-глобина свиным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человеческий гемоглобин, продупируемый трансгснными свиньями, обладал такими жс химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией.

Эти результаты указывают на принципиальную возможность замены цельной крови, используемой при трансфузии, человеческим гсмоглобином, полученным методом трансгсноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро разрушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны Лля почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгсноза— это дело далекого будущего. В последнее время болыпос внимание уделяется вопросу об использовании органов животных для трансплантации человеку.

Основная проблема межвидовой трансплантации — это гипсрострое от.оржснис. Гиперострос о ггоржение влечет за собой связывание антител организма- хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря псрссажен ного органа. В естественных условиях воспалительная рсакпия блокируется особыми белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов.

Эти белки — ингибиторы комплемента видоспсцифичны. Было высказано предположение, что сели бы животное-лонор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующсго комплемент, то пересаженный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенныс свиньи, нссушис различныс человеческие гены ингибитора комплемента. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента.

Предваритсль- ныс эксперименты по пересадке органов трансгснных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган нс отторгается немного долыпс. Возможно, трансгенные свиш и, несущие человеческий ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вгязывает острейшее отторжение, будут служить источником органов лля трансплантации человеку. Транегенные птицы Микроинъскция ДНК в оплодотворенныс яйцеклетки птиц с целью получения трансгснных линий — непростая процслура.

Это связано с некоторыми особенностями воспроизволства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцсклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а нс один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже нс подходит, поскольку в этом случае ДНК нс интегрируется в геном оплодотворснной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микро- инъекцию ДНК в ядро„дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцсклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем гшьбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками.

Однако трансген можно вводить в область желтка (зародьпвсвыи диск), которыи содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образуется раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклстку культивируют ш и1го, и когда образуется зародыпц его помешают в суррогатное яйцо„чтобы имитировать вылуплснис. При помощи такой стратегии была получена одна линия трансгенных цыплят. Однако в настоящее время этот метод неэффективен и технически трудповыцолпим в обычных условиях. К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, зародыш, нахоляшийся на стадии бластолсрмы, состоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции тако- Выделение кяеток бластодормы сфекция С)баучснная бластодерма Химера Рис.

гр.!4. Получение трансгениых цыплят трансфекцией гизолгы рованных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародьцпевую область облученной бдастодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансгсн в клеях зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям. Тралсгепное животное-основы ель Трансгенные животные 437 | Введение трансфицироеалг1ых клеток бластодермы в подзароды|деаую область и | Подэародыгаеаал область 458 ГЛАВА 19 го зародьппа ретровнрусными векторами с наруп1енной рспликацией, несущими бактериальныс марксрные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несу1цие чужеродныс гены в клетках зародышевой линии.

Характеристики

Список файлов книги