Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 127
Текст из файла (страница 127)
Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены транс!енные мыши, комозиготные по трансгену. В специфический хромосомный сайт ЕЬ- клеток можно не только встроить трансген, кодирую!ций какую-то новую функцию, но и направленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодируюи1ей областью специфической последовательности (обычно селективного маркер- ного гена) (рис.
19.7). Одна из залач направленного нарушения («нокаута») гена состоит в исследовании влияния этого процесса на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в определенном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне. Например„направленный «нокаут» гена родопсина мыши приводит к инактивации палочек сетчатки, что имитирует такую болезнь человека, как пигментный ретинит. На мышах с «нокаутированным» геном родопсина можно изучап процесс дегенерации сетчатки, а также 426 ГЛАВА 19 Х мосома Вектор Хромосома ,-р. лт; 1 - «а<а: 5 терапевтический эффект лекарственных среде<в, замедлеощих или вообще останавливающих генетически обусловленный патологический процесс.
Уже создано более 250 линий мь<шей с «нокаутированными» генами, используюп<ихся н качестве моделей для изучения различных заболеваний человека. В принципе подходы к созданию трансгенных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей Функций» сходны. К сожалению, плюрипотентпые ЕЬ-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупною рогатого скота, овец, свиней и цыплят, но их поиск прололжнется.
Кяоииронииие с иомои1ыи переноси ядри Плюрипотентность можно выявить„если перенести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способность последней к разнитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких лабораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбрионшп,ных клеток, клеток гшола и взрослой особи. Было показано, что ядра эмбриональных клеток способны— хотя и с низкой эффективностью — обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи. Всем известная овца по <имени Долли была каониронана с помощью переноса ядра клетки мо- Рвс.
!9.7. «Нокау<» гена с помощью направленной гомологичной рекомбинапии. Вектор несет селективный маркерный ген (ап<В) и фланкирующие ею последовательности, гомоло<ичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять зкзонов (1 — 5). В резуаьтше гомолоп<чной рекомбинации (штриховые линии) ген-мишень прерьи<естся («нокаутируекя»).
ночной железы (нымени) взрослого жив<па<ого (рис. 19.3). Гак впервые была доказана плюрипотентность ядра дифференцированной взрослой клетки. Впрочем, нельзя исключить, что на самом деле донорское ядро бьщо нзято из недифференцированной клетки, присутствовавшей н эпителии л<олочной железы организма- донора. Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (()о), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного.
Дело атом, что в течение первых трех делений зиготы овцы, занимакицих несколько сугок, происходит только репликация ДН К, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, <то за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соотнетствувшие гены эмбрионального развития связь<веются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.
Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных животных с помощью л<етода переноса ядер стало реальным, — это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание транщенных организмов станет почти рутинной процедурой. Однако вследствие видовых различий но времени процесса деления Трансгеннчае животные 427 Эпителий молочной железы Я '(~':::; 'Я',Я;Оз: яацекчетка Разделение клеток ~ йырацчиааиие а культуре О~ Оооо Индукции фазы С„ О~др ~~~~ Дяд~ ф~ Слияние Активация Микропипетка Удаление лара Ядро Культивирование Имплантации чСуррогатиаа» ма Клоиироааии овца Рис.
19.8. Клонирование овцы мстолом переноса ядра. Ядро яйцеклетки удаляют с помошью микропицетки. Культивируют эпитслиальныс клетки молочной железы взрослой особи и инлуцируют нх переход в фазу С,. Осуществляют слияние клеток в Сч,-фазе и яйцеклеток, лишенных ялра, и вырашивают восстановленные яйцекцтки в культуре или в яйцсводе с наложенной лигатурой ло ранних стадий эмбриогенеза, а катом имплацтируют их а матку есуррогатнойь матери, где и происходит дальнейшее развитие. В эксперименте, описанном Уилмутом и др. (туйпш1с! а1.,!997), было провалено слияние 277 айцсклсток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе Сч„; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода. 428 ГЛАВА 19 ° ° Генетическая трансформация эмбрионов мыши микроинъекцией очищенной ДИК !.
>Ч. Согйоп, С. А. Бсапйоз, Г>. !. Р!о!)г!и, 3. А. ВагЬоза. К Н. Кп«Ы)е гтос. Нигг Ложг. Вс! 15ВЛ 77: 7380 — 7384, ! 980 Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простого герпеса в соматических клетках мыши после инъекции рекомбинантного гена в яйцеклетки К. 1..
Вппыег, Н. Ч. С!зеп, М. ТпппЬаоег, А. Ч«'. Бепеаг. К. >Чаггеп, К. (>. Ра!пн!Сг С«!! 275 223 — 231, 198! мидная ДНК не была интактна, и ген тимидинкипазы НВЧ ие стал трансгепом. Бринстер и др. инъецировали ген тимилинкииазы НВЧ пол контролем промотора гена металлотиопеипа-! и обнаружили, что у одной из полученных трансшнных мышей сннзсзировалось больше тимилинкиназы НВЧ в клетках печени и почек, чем у трех других, синтезировавших этот фермент лишь в небольшом количестве. Кроме того, восемь лругих трансгеиных животных несли геп тнмизинкиназы НВЧ, но не синтезировали активного фермента.
По данным Саузернблозтинга, у всех трансгеш<ых мышей введенная ДНК присутствовала в большом числе копий. Эти лва исследования послужили основой экспериментов по клетки на ранних стадиях эмбриогенеза и инициации транскрипции в этот исриод пока не асио, удастся ли осуществить перенос ядра в случае каких-либо других домапших животных, кроме овец, если донорское ядро будет находится на той же стадии, что и яйцсклетка. полноразмерные гены и мультигсниые комплексы (л100 т.
и. И.) слишком Вслики 5!л51 Встраивания в обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать искусствсиныс дрожжевые хромосомы (ЧАС), вмещающие фрагменты гсномиой ДНК длиной от 100 до >1000 т. и. н. Транс! снных мышей получали мнкроинъскцисй в пронуклсус оплодотворенной яйцеклетки илн трансфекцисй ЕБ-клеток с помо!Лью ЧАС, несущих несколько родственных генов или один большой ген. Траисгсииыс мьппи, несущие кластер нз пяти функциональных генов !3-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т. и.
н., экспрсссировалн все эти гены тканссиецифнчно и в нужное время — точно так же, как эзо происходит у человека. Такое соотвстст- Х7еренос ге!гав г пол!в!!(ью искусспзвеиньгх дрожжевых хролгвсоги Г>ольшинство трансгсиов представляют собой кДНК, небольшие гены (<20 т. и. И.) нли фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо эксирсссируются в клетках млекопитающих, а когда трансгсном служит гсномная ДНК, важные гсноспецифнчиыс рсгуляторныс последовательности, расположсиныс до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки.
Кроме того, Впервые возможность переноса ДНК при помощи микроинъекций в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши была проиллюстрирована Дж. Горлоном и др. В этом эксперименте в несколько сотен оплолотворенных яйцеклеток инъсцировали плазмидный вектор рВК322, содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (НЯЧ) и часзь генома обезьяньего вируса 40 (БЧ40).
Нз 78 потомков, рожденнзях приемными матерями, два солержали плазмилную ДНК. Авторы слелали вывод, !то «эти лаппые свидетельствуют о возможности использования рекомбинантных плазмил в качестве вектора лля введения чужеродных генов непосредственно в эмбрионы мышей, которые сохраняют эти гены в ж>- де развития«. К сожачению, плаз- трансгенозу мышей. Несмотря 5«з техническую сложность и относительн> кз неэффективность метода с использованием микроинъекций, эти эксперименты оказались вполне успешными. В настоящее время различные линии мышей, которые несут чужеродные гены (трансгенные мыши) или собственные гены, вывеленные из строя интеграцией фрагмента чужеродной ДН К («нокаутированные«гены), используются в са>5ых разных целях: лля ИЗУЧЕНИЯ ПРОЦЕССОВ РЕГУзашнн ГЕ- нов и развития млекопитаюших, возникновения вирусных заболеваний и рака, мугагенпых эффектов различных агентов и многого другого.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
