Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 125
Текст из файла (страница 125)
Повышение эффективносзи усвоения пиши всего на несколько процентов может существенно снизить стоимость конечного продукта (говядины, свинины и т. д.). Идея генетического изменения животных путем введения генов в оплодотворенные яйпеклетки была реализована на практике в 1980-х гг.
Как и во многих лругих новых областях науки, для упрощения обмена информацией между учеными был введен ряд новых терминов. Так, животное, чей генотип был изменен путем введения чужеродной (экзогенной) ДНК, было названо трансгенным, вводимая ДНК вЂ” трансгеном, а весь процесс— трансгенной технологией, или трансгенозом. Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов путем введения в них трансгенов требуют много времени, Тем не менее трансгеноз стал мощным инстру- Трансгенныс жино ~ ныс 4!9 таблица 19.1. Белковый состав (г/л) молока коров и овсы Овца Корова Кмснн ал-Квлсин ач -Клтсин к-Квзснц 13-Клчснн Основные бслкн сыворотки а-Лактлльбумнн б-Лкколнбуынн Другие бслкв Сывороточ ныл вльбум он Ливонии 12,0 3,8 4,6 16,0 10,0 3,4 3.9 10,0 1,0 3.0 0,8 2,8 0,4 11с обнвружсн Цс обнаружсн Слсловыс колцчсствл О,1 Нс обнаРужен Нс обнвру коны Лак гофсррнн Иыыуноглобулниы Трацегенцые мыши: методология Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах.
С начала 1980-х ьп в различные линии мьпцей бы- ментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, лля создания модельных систем. позволяюзцих изучать болезни человека, а также для генетической модификации клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных лля медицины белков. Был даже предложен новый ТЕРМИН сфаРМИНГв, ОтНОСЯ1ИИйСЯ К ПРОЦЕССУ ПО- лучения из молока трансгенных домашних ("р)гаг1п") животных аутентичных белков человека или фармацевтических препаразов. Использование молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в большом количестве и епз можно надаивать по мере надобности без вреда для животного.
Вырабатываемый молочной железой и секретируемый' в молоко новый белок не должен Ари этом оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергаться постзрансляционным изменениям, которые по крайней мере близки к таковым в клетках человека.
Кроме топх его выделение из молока, которое содержит и другие белки (табл. ! 9.1), не должно составлять болыпого труда. ли введены сотни генов. Эти исследования в значительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развигия опухолей, природы иммунологзлческой спепифичности, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процессов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возлсожности крупномасппабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трапсгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека.
Ввеление чужеролной ДНК мышам можно осуществить разными методами: 1) с помощью рстровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйпеклетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных спюловых клеток в прсдимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития. Использование ретровирусных векглорое Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис.
19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. и. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных послеловательностей, необходимых для его экспрессии. Использование ретровирусных векторов имеет и сщс олин большой нелостаток. Хозя эти векторы создаются так, чзобы они были дефектными по репликации, геном штамма резровируса (вируса-помощника), который необходим лля получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген.
Несмотря на все принимаемые меры, ретро- вирусы-помошники могут реплицировгггься в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных преЛ- полагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альзернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. 420 ГЛАВУ« 19 Самка, у которой ннлуцнроеана гнпсровуляция ка-лсиор Женский— пронуклеус У.: Мужскон пронуклсус *';.~' )2.
У эмбрион Ре»ровирус Оплодопюрепная яйцеклетка Иньекционная ) пипетка Фиксирующая пипетка Трансы н !)й:...: "'„' «а — йвБЕ3 Трансге н —.— .у Оплодсчворенпая яацеклетка мка мплаптантом Самка с нмпла ро яйцсклеткой » й ~ ~~й~йф)й9 ~ Трансгеппое животное-основатель Трансгенное животное Рис. 19 1. Получение линии трансгепных мьшгсй с использованием ретровирусных векторов, Эмбрион, обычно находящийся на сталин 8 клеток, инфипируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансгсн. Самки, которым бьш импланггирован эмбрион («суррогатные» матери), производят на свсг чрансген нос потомство.
Ддя идентификации мышат, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний. Метод лгггкроинъекций ДИК В настоягцее время для создания траисгенных мы- шей чагце всего используют метод микроиньекцнй ДНК. Он заключается в следующем (рис. 19.2).
Рнс. 19.2. Получение линий трансгенных мышей метолом микропнъекций. Яйпскле тки выделяют из самок-донороп, у которых была нндуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгснную конструкцию ннъсцируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйпеклетки илшлантнруют в «суррогатную» мать, которая производит на свеч транс1ецных мышат — основателей транс~снпых линий. 1. Увеличение числа яйцеклеток„в которых будет инъецпрована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок-доноров.
Сна сала самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя примерно 48 ч— хорионический гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется примерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5 — 10. 2. Скрещивание с самцами самок с гиперовуляцией и их умерщвление. Вымывание из яйце- волов оплолотворенных яйце клеток. 3. Микроиньекция ДНК в оплодопюренные яйцеклетюи — как правило, сразу после выделения. Часто вводимая трансгенная конструкция находится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей.
У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) н ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как пошгеднее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронукчеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужероднук! ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроипъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный эксперимен гатор за день может инокулировать несколько сотен яйпеклеток. !00 80 Ь".
70 Ф 60 й 50 гл Зо 20 !О Ииъекци» Имплантация Жяяорожд«няо«!ран«минос псюиство потомство Рве. !9.3. Суммарная эффективность трансгеиоза после микроииъекций. Все оцлологворенные яйцеклетки (!00%) коровы, свиньи, овцы и мыши инокулировали трансгеиом, однако успешная имплантация и появление потомства были редкими событиями: трансгенное потомство давали менее 5% обработанных яйцекхеток. Транс!еиные животные 421 После введенггя ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирурп«ческим путем в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность скрещиванием с вазэктомированным самцом.
У мышей спаривание — это единственный извесгный способ подпповки матки к имплантапии. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйце- клеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.
Для идентификапии трансгенных животных выделяюг ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блоты ибридизации по Саузерну методом полимеразной цеплой реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков Лля получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий.
Описанный подхол кажется на первый взглял относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококва!ифицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в лучшем случае лишь из 5% ннокулированных яйце- клеток (рис. !9.3). Ни один из этапов эксперимента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необхолимо использовать боль- 422 !'ЛАВА 19 пюе число оплолотворенных яйцеклеток. Например, при получении трансгенных мышей ! юсле инъекции ДНК выживают только б6% оплодотворенных яйпеклеток; мьппата развиваются примерно из 25% имплантированных яйцеклеток, причем трансгенными из них оказываются лшпь 25%. Таким образом, из 1000 имнлантированных оплолотворенных яйцеклеток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
