Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 129
Текст из файла (страница 129)
Конструкция «кДНК АР1' — интроны» находилась под контролем промотора гена (3-фактора роста из тромбоцитов, экспрсссируюшегося в тканях мозга (рис. 19.11). Вся она была названа мини-геном РОА!зР. У стареющих трансгснных мышей (старше 6 месяцев), несущих около 40 копий Р!зАРР, образовывьшнсь амилондные бляшки„отмечались гибель нейронов и дефекты памяти.
Конструкция АРР-670/671 под контролем нейроспецифичного промотора вызывала у трансгенных мышей симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера, в том числе образование избыточных количеств А!342. Интересно, что ни у стареющих мьппсй, несущих РВА!'Р-мини-ген, нн у транс- генных мышей АРР-670/671 нсйрофнбрнллярные клубочки не обнаруживались. Возможно, эти структуры возникают у человека как следствие сверхпролукции А!342. В развитии болезни Альцгеймера у человека участвуют ешс три гена — АдоЕ4, гены пресенилина 1 (Р57) и прссснилина 2 (Рз2). Наличие адлеля АроЕ4 покуса АроЕ, который ответствен за 432 ГЛАВА 19 Проиаюр ына 11-фактора роста из тромбояитов Сигню волиааенилигевяння А, В ! 2 3 4 5 б 7 С Фг ';: т:":..:2!::;33":;' "' '-:, 8 9 !! !2 !3 14 15 !6!7!8 Рие.
19Д1. Генетическая конструкция, называемая мини-генам РПАРР, с помошьао которой можно моделиро- вать развитие болезни Альцгеймера у транс генных мышей. 1 — 10 — эюог!ы кДН К белка-предшественника амн- лоила, А — С вЂ” введенные иптропы. Регуляторными элементами являются нромотор гена 11-фактора роста из тромбонитов и сигнал полиаленилирования вируса ВЧ40. транспорт липидов, коррелирует с увеличением вероятности возникновения болезни Алыц еймсра у людей старше 60 лет. В семьях, где отмечается развитие этой болезни в мололом возрасте, обнаруживаются мутации в генах пресенилинов, однако роль каждого из них в развитии данной патологии не вьиснена. По данным разных авторов, мутации в генах пресснилинов приводят к увеличению аккумуляции А))42 Например, у дважды трансгенных мьппсй, полученных скрещиванием трансгенных мь!ц!ей, которые несли полноразмерный человеческий ген АРР„с мышами, несущими мутантный ген прссенилина 1„ отмечалась сверхпродукция А))42.
Пока о патогенсзс болезни Альцгеймера мало что известно, но сеть надежда, что животныс модели помогут ответить на некоторыс важные вопросы о ес молекулярных основах. В США эта болезнь поражает ежегодно около 4 млн. человек, и наносимый сю ущерб составляет порядка 100 млрд. долларов. Трансгснных мышей использовали также в качестве модельных систем для изучения экспрессии генов, кодирую!цих трансгснные продукты, которые сскретируются в молоко. Так, для изучения функций белка. нарушения в котором приводят к муковисцидозу (СГТК), и лля разработки подходов к лечению муковисцидоза (СГ) необходимы большие количества аутентичного СГТК-белка Муковисцидоз — распространенная генетическая болезнь, поражающая в странах Европы одного из 2500 новорожденных.
Первичный эффект дефектного СГ-гена — это изменение функции СГГК, который в норме служит каналом д гя ионов хлора. В результате блокирования потока этих ионов в клетку и из клетки в протоках нскоторых органов, особенно в легких и поджелудочной железе, скапливается слизь. Она становится источником бактериальной инфек- ции, которая с трудОм !юддается лечению антибиотиками. ДНК, высвобождающаяся из лизировавших бактерий, делает слизь очень густой. Загустевшая слизь забивает протоки, нарушается нормальная работа органа и симптомы муковисцидоза еще более усиливаются.
Продолжительность жизни больных муковисцидозом составляет в настоящее время 25 — 30 лет. Для того чтобы лучше изучить механизм действия СГТК, необходимо иметь этот белок в достаточном количестве. Все известные клеточные системы экспрессии !и т11го нс обеспечивали сто эффективного синтеза. Возможно, это связано с аккумуляцией СГТК в мембранах трансфицированных клеток.
Решить зту проблему можно было бы постоянным удалением плазматичсских мембран из хозяйских клеток. В такой системе гетсрологичный трансмембранный белок связывался бы с отлсльнымн фрагментами плазматичсской мембраны, что значительно облсгчшю бы его концентрирование и очистку. Аналогичный механизм используется клетками молочной железы лля образования глобул жира в период вскармливания. Жировые капельки инкапсулируются в плазматической мембране и в таком виде секретируются в молоко. Чтобы проверить действенность этой системы, полноразмерную кДНК СГТК встроили в середину дефектного гена 1)-казвина козы, из которого был удален участок от конца экзона 2 до начала экзона 7 (рис.
19.12). Получившаяся конструкция содержала промотор и сигнал тсрминации транскрипции гена 1)-казвина козы. При этом кДНК СГТК была встроена в структурный ген с интронами, благодаря которым повышалась эффективность транскрипции трапсгена. Ген 1)-казсина активно экспрсссируется в клетках молочных желез в период вскармливания, и этот белок является основным белком молока.
Трансгенные животные 433 ех8 кднк СГТК ЕХ1 ЕХг ЕХ7 ЕХ9 р кя!«яяа козы Ряс. 19.12. Генетическая конструкция «кДН К СГТО— ген 11-казеина козы». Пгян!г!размерная кДНК СГТК встроена ме:клу экзонами 2 (ЕХ2) я 7 (ЕХ7) гена (1-казеииа козы. Сохранены вромотор, терминатор и экзоны 1, 8 и 9 (ЕХ1, ЕХЗ и ЕХ9) гена казеина. Были получены линии трансгенных мышей, несущих кДНК СГТй нод контролем рсгуляторных последовательно!:тей гена 1)-казвина. Как и ожида!ось, в молоке трансгснных самок содержался СГ1й-белок, связанный с мембранами глобул жира. Никаких отрицательных побочных эффектов у кормящих СГТК- !рансгснных самок или у мьииат, вскормленных их молоком, нс наблюдалось. СРТ(1 был гликолизирован и легко экстрагировался из жировой фракции молока.
Остается только выяснить, является ли он аутентичным белком. Исследовалась также возможность получения других мембраноснязанных белков с молоком. В клетках молочных желез трансгснных мышей в период лактации синтезируется множество белкон, лредставляющнх интерес для медицины. Но чтобы иметь возможность получать СРТ(з, другис трансмембранныс белки и различныс белки человека в больших количествах, соответствующие трансгснные конструкции необходимо встраивать в геном более крупных млсконитающих — коровы, овцы или козы.
Трансгенный крупный рогатый скот Если прсдлолагается использовать молочную железу в качестве «биорсактора!ч то наиболее предпочтительным животным лля трансгеноза яв'шется крупный рогатый скот, который ежегодно даст до 10 000 л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л.
Если в молоке будет содержаться такое количество рскомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному сонладснию„именно столько белка С, иснользующегося для предотвращения тромбообразования, требуется ежеголно. С другой стороны, олной трансгснной коровы будет более чем достаточло для получения требуемого ежегодно количества фактора 1Х (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который вводят больным гемофилией для ловьииения свертываемости крови. Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мьлией методом микроиньскций ДНК (рис.
19.13). Процедура включала следующие основныс этапы. 1. Сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне. 2. Созревание ооцитов ш я11го. 3. Оплодотворение бычьей слсрмой ш Игго. 4. Цснтрифугированнс оплодотворснных яйцеклсток для концентриронания желтка, который в нормальных яйцеклстках мешает визуализации мужского иронуклеуса с помощью секционного микроскопа. 5. Микроинъскцигг ДНК в мужской лронуклсус. Ь. Развитие эмбрионов !и зчгго.
7. Нсхирургическая имплантация одного эмбриона рсцилиснтной самке но время точки. 8. Скрининг ДНК потомков на наличие транс- гена. В тестовых экспериментах из пула в 2470 ооцитов были получены два трансгснных теленка. Этот результат указынаст на результативность описанного подхода, но также н на его низкую эффективность. Исследования в этой области лродолжаются, и есть надежда на усовершенствование методики тралсгсноза. Налримср, скоро ноявится возможность отбирать нсболыиое число клеток у развивающегося эмбриона 1и Игго и тестировать их на наличие трансгена; такая потеря клеток эмбрионом нс помешает его нормальному развитию. Этот тест позволит имплантировать только эмбрионы, несущие трансген.
Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в молоке различных комлонснтов. Так, количсстно сыра, лолучаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казсина, поэтому весьма 434 ГЛЛВЛ 19 Свар еедотев Созревонве !и У11ге Оплодотворение гп Иве Цевтрвфугвреоание олледотоеремпык лявеклетек М окреп нъекдво ДИК вмукекаяпропуклеуе Развитое змбровпов (п у(его де следов блаетецие1ы Имплонтлдио эмбрвепео Скрянввг ДНК потомков влнллвчвецанегена Рве. 19.13. Получение трансгенных коров. перспективным представляется увеличение количества синтсзирусмого к-казвина с помощью гнперэкспрессни трансгсна этого белка. Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках люлочпой железы, то можно булет получать молоко, нс содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для многих людей„нс исрено- сящих лактозу; после приема молока или молочных продуктов у них возникает серьезное жслудочнос расстройство.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
