Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 128
Текст из файла (страница 128)
Кроме того, трансгенные мыши и мьлли с «нокаупзрованным«геном предо!являют ии5ерес как модельные системы для исследования болезней человека. 7раисгенные животпыс 429 вис обеспечивалось фланкирующими их послсдовательностями, ко<орые содержат промотор и другие важные рсгуляторныс элементы. Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примечательный пример трапсгеноза с помощью <АС. Как отмечалось в гл. 1О, моноклональныс антитела можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить человсчсскис моноклональныс антитела практически невозможно.
К сожалению, и моноклональныс антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы «очеловечить» существующие моноклональныс антитела грызунов, были разработаны сложныс стратегии с использованием рекомбинантных ДНК. В результатс этих трудоемких процедур удалось получить Г«- и ГаЬ-фрагменты, зачастую облалающис каким-то сродством к специфическому аптигену. Возможно, технологического прорыва удастся достичь, сели использовать для получения полноразмерных человеческих антител более доступный метод с использованием гибридом. Синтез природных антител — это настоящее чудо. Аптитсло — очень сложная тетрамерная конструкция„состояща«из двух пар разных цепей.
Одна из них называется тяжелой (Н), а другая — легкой (к или к). Эти термины отражают различия в молекулярных массах субьединиц антитела. Генетические особенности каждой тяжелой цепи определяются комбинацией вариабсльного (Ъ'н)„дивергентного (Р„), шарнирного ()н) и константного (С, ) участков (доменов) соматической ДНК в В-клетке. Известны два типа легких цепей, ). и к„которые образуются в результате перестройки их собственных вариабельных (ЪХ, Ук), шарнирных (3)„)к) и константных (С)., Ск) доменов. Данная В-клетка синтезирует один вид антител, с уникальной комбинацией участков, составляющих Н-цепь, и либо перестроенной ).-, либо к-цепью. Набор генетических элементов, обеспечивающих образование множества разных Н-цепей антител человека, включает около 95 << -домен нов, 30 Рн-доменов, 6 3п-доменов и 5 основных константных (Сей Су, СЬ„Се, Ср) доменов. Локус к-гснов содержит примерно 76 Ук-доменов, 5 )к-доменов и один константный (Ск) участок (рис.
19.9). Размер Н-покусов и к-генов — от 1 до 1,5 т. п. н. Для создания трансгенных мьппсй, способных синтезировать множество различных человеческих антител, необходимо инактивировать мышиные гены Н- и (=цепей, а затем встроить в хромосомную ДНК мьппи 3<АС, содержащую гены Н- и 1 -цепей каждого человеческого гена иммуноглобулина. Чтобы решить эту задачу, мьппиныс гены Н- и к-цепей были заменены («нокаутированыь) неболыпим участком кластера генов Н-цепи человека (который включал 4 3<, -домена, 16 Рндомснов, 6 )н-доменов, СТ и Ср) и кластера генов к-цспи человека (содержащего 4 Ъ'к-домена, 5 )к-доменов и Ск).
Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигснам; кроме того, были созданы гибридомы, продуцирующие чсловечсскис моноклональные антитела. Однако разнообразие человеческих антител, продуцирусмых такими трансгенными мышами, бьщо невелико вследствие ограниченности набора вариабельных сегментов Н- и к-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали г"ЛС с бблыпим числом генов вариабельных участков Н- и к-цепей гемоглобина человека.
Объединив четыре разные УЛС с генами Н-цепей гемоглобина человека, создали г'АС длиной 1000 т. и. и., несущую 66 Ч, -доменов, около 30 Р,-сегментов, 6 )н-доменов, Ср, Сб, и Су. Аналогично, из трех ЪЛС, несущих различныс домены Чк, созлали г"АС длиной 800 т. и. н. с 32 Ук-доменами, 5 Мк-доменами и Ск. Е8-клетки трапсфицировали по отдельности <АС с генами Н- и кцепей методом слияния клеток, отобрали клетки, в которых произошла интеграция УЛС, с помощью селсктивного маркера и проверили целостность каждой вставки методом ПЦР.
Инъсцировали клетки, несушис встроенные гены Н- либо к-цспи, в бластоцисты и идентифицировали особь-основатели с помощью П ЦР. Трапсгенных мышей со вставками генов Н- и к-цепей скрещивали по отдельности с мышами с инактивированными локусами этих цепей. Затем потомство скрещивали между собой, чтобы получить мышей, лишенных функциональных мьпииных генов Н- и к-цс«ей, но несущих обе вставки генов Н- и к-цепей гемоглобина человека. Трапсгснныс мыши с увеличенным числом человеческих <гн- и <гк-доменов синтезировали 430 Г!!ЛВА 19 Чн Основные Сн-домены Он !н Чн И " 7 Рис. 19.9. Схематичное изображение генов к- и Н-цепей иммуноглобулннов человека. А.
Строение гена к-цепи иммуноглобулина в клетках заролыпшвой линии. Штриховая линия — промежуточные дамены, здесь не показанные. Ген функциональной к-цепи, например Чкй-!к4-Ск, образуется в В-клетках в результате нескольких перестроек соотвстствукцпих ДИК-ломенов. Представленная здесь комбинации — лишь одна из 500 возможных. Б. Строение гена Н-цепи иммуноглобулина в клетках заролышевой линия. 11!триховая линия — промежуточныс ломсны, злесь не показанные. 1'ен функпиональной Н-цепи, например Ч„33-1)„26-)н4-Са, образуется в В-клетках в результате ряда перестроек соответствующих ломенов.
Представленйая здесь комбинация — лишь олна из 140 000 возможных. На рисунке показан только один Су-домен, хотя на салюм леле их четыре !Су1, С'!2а, Су2о и СуЗ). человеческие антитела. Их иммунизировали тремя разнылеи антигонами, и в каждом случае гибридомы секрет провали человеческие моноклональные антитела, обладающие высоким сродством к антигону, которым животныс были иммунизированы. Весьма вероятно, что с помощью такой трансгснной системы удастся получать человеческие моноклональныс антитела для использования их в мслицине. Трансгенные мыши: применение Трансгенные мыши могут служить модельными системами д;и изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза пролуктов, представляющих интерес Лля медицины.
Используя целых животных, можно моделировать н возникновение патологии, и ее развитие. Однако мьппь — не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэтому данные, полученные на трансгенных моделях, ~ ~с всегпа можно экстрагюлнровать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее в некоторых случаях они позволяяп выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генетических болезней человека, как болезнь Альцгей- мера, артрит, мышечная дистрофия„образование опухолей, гипертония, нсйролегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосулистые заболевания и многие лругие.
Болезнь Альцгеймера — это дегенеративный процесс, приволящий к утрате клеток различных отделов головного мозга. Наиболее ранним проявлением служит ухудшение памяти. Этот процесс прогрессирует, к нему присоелнняются утрата способности к абстрактному мышлению. измецснис личности, нарушения речи, снижение физического статуса. Патология наблюлается у 1% людей возрастной груш 1ы от б0 по 65 лет н у 30% люлей старше 80 лет.
При ~~атоморфологячсском исслеловании в тслс нейронов обнаруживаются нсйрофнбриллярные клубочки, а у синаптичсских окончаний — плотные агрегаты. называемые сснильными бляшками (рис. 19. !О). Кроме того„в кровеносных сосудах мозга обнаруживаются конгломераты — амилоидные бляшки. Основным компонентом ссннльных и амилоилных блягцек является белок Ар (амилоид 1з, ))-белок, р-амилоидный белок„Р/А4) мол. массой 4 кЛа. Существуют А13-белки с разным числом аминокислотных остатков, например А!340 и А)342. Все оци образуются в результате протсо- Транстснные животные 431 денлргп ибрнлллрныс л Ссллллнлы бляшка Рис. 19.10.
Схематическое изображение нейрона коры головного мозга человека с указанием некоторых гистологических особснносзсть характерных для болезни Альцгеймера. У сннапсов образуются сеннльные бляшки, содержащие ал1нлонлныс скопления н обломки клеток„В теле нейрона накаплнвакпся нейрофнбрнллы, включающие а~регаты нз белков пипн скелета н яру~их белков. Происходят н другие изменения, здесь пе показанные.
литического расщепления белка-прелптсственника (А1'Р). ! !ричины аккумуляции А(3-белка не установлены. Члены некоторых семей, в которых с высокой частотои встречается болезнь Альцгеймера несут мутации в гене АРР, что наводит на мысль об участии этого гена в возникновении данной патологии.
К сожалению, прослелить в деталях за возникновением и развитием болезни Альцгеймера на человеке не удается. Неоценимую помощь в этом могла бы оказать какая-нибудь «животная» модель. Было получено множество трансгснных мышей, несущих полноразмерный ген АРР или его часть под контролем нейроспецифичного промотора. При этом у болыпинства животных об- разование амнлондных бляшек, нейрофибриллярных клубочков, гибель нейронов или нарушение поведения нс отмечались.
Однако у животных, несущих трансген, кодирующий участок из 100 последних аминокислот АРР, который включал и А!)-белок, обнаруживалась дсгенерапия нервных тканей, аналогичная таковой при болезни Альцгеймера. Более адекватные «животныс» модели, позволяющие изучать болезнь Альцгеймера, были созданы с использованием трансгенов, содержащих мутации в гене АРР, характерные для некоторых семей с высокой частотой встречасмости болезни Альцгеймера в раннем возрасте («50 лет).
У одной ~руины таких семей в положении 717 АРР (АРР-717) вместо валгина присутствовал фенилаланин, в другой ~рупие в положениях 670 и 671 АРР (АРР-670/671) лизин и метиониц были заменены на аспарагип и лсйцин соответственно. Трансген с мутацией АР!'-7! 7 был создан на основе кДНК АРР встраиванием между экзонами 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9 модифицированных интронов. Иптроны вводились потому, по, согласно данным эксперимента, содержащие их трансгены транскрибируются более эффективно, чем трансгены без интронов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
