Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 140
Текст из файла (страница 140)
и., и те, которые содержат последовательности из повторяющихся элементов ДНК человека. Наличие повторов определяют при помощи компьютерных программ, сравнивая пуклеотидпу1о последовательность вставки с последовательностями всех известных повторов ДНК человека. Затем для каждого отобранного клона находят пуклеотидные последовательности праймеров.
Каждый Я 8 тестируют на предмет уникальности амплифицируемого фрагмента хромосомной ДНК. С помощью П ЦР-скрининга выявляют ВТВ в индивидуальных клонах библиотеки с крупными вставками, а затем, основываясь на распределении 8ТБ в клонах, численными методами находят вероятный набор перекрывающихся клонов и относительное положение имеюгцихся ЬТ8 (рнс.
20. 18). С разработкой метода РГ- картирования появилась возможность без особого труда упорядочить ЗТЗ, что облегчает идентификацию составляющих контига (рис. 20.19). Выявив перекрывающиеся клоны, определяют степень их перекрывания, размер контига и общую длину охватываемой им ДН К, с помощью эндонуклеазного картирования с использованием электрофоретической системы, разделяющей фрагменты ДНК длиннее 105 и.
и. (например, импульсный электрофорез). Уже получены контиги хромосомных районов, охватывающие от 1 до более чем 20 м. и. н., а в ряде случаев — и целые хромосомы. В конце концов будут получены контиги из крупных фрагментов ДН К, перекрывающие весь геном. Построение коитигов из кослшдиых, Р)- и 2.-библиотек Ьолее удобными лля генетических исследова. ний и широкомасштабного секвенирования часто оказываются контиги из небольших фрагментов ДНК, чем из крупных.
Для построения контигов определенных районов хромосом или целых хромосом нередко используют космидные библиотеки. Обычно перекрывающиеся космидные клоны идентифицируют методом геномной дактилоскопии. Для этого из каждого клона экстрагирукп ДН К и обрабгп ывак1т ее рестриктазой. Г1олученпые фрагменты метят, разделяют при помощи электрофореза и внзуализируют радиоавто~рафическими методами. Каждый клон порождает специфический набор фрагментов — уникальный отпечаток его ДНК; у перекрывающихся клонов один или несколько фрап |ентов совпадают. Для концевого мечения ДПК-фрагментов— независимо от характера образующихся после эндопуклеазной обработки концов (5'-, 3 -выступающих или тупых) — можно использовать реакцию замещения, катализируемого ДНК-по. лимеразой Т4.
В этом случае к препарату космидной ДНК, обработанной рестриктазой, добавляют ДНК-полимеразу и один меченый дезоксинуклеотид (рис. 20.20). Под действием 3 -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы происходит последовательное отп1епление 3'-концевых нуклеотидов. Процесс продолжается до тех пор, пока в противопложной цепи не экспонируется нуклеотид, комплементарный меченому дезоксинуклеотиду, добавленному в реакциош~ую смесь. Далее включается полимеразная активность ДНК-полимеразы, и к 3'-концу присоединяется свободный меченый нуклеотид.
Поскольку другие нуклеотиды в реакционной смеси отсутствуют, дальнейшего роста цепи не происходит. Для мечения эндонуклеазных фрагментов существу1от и другие способы. Усеченный 3'-конец фрагмента можно удлинить (достроить) прн помощи фрагмента Кленова, использующего выступающий 5'-конец в качестве матрицы; достраивание осуществляется за счет добавленных в реакционную смесь дезоксирибонуклеотидов, один из которых несет метку. Кроме того, к вы- 464 ГЛАВА 20 Г2 Ы О Ы с а — а — -а- — а — а Ы !3 6) 4 2 По 14 15) 13 2 (1О 14 15) 13 1 5 ь а-- — а — а — а — а — а — а 1 5 7 В д и — -а — а — — а 7 6 Я се — -е — -а Ряс.
20ЛЯ. ЯТЯ-картирование. А. ЯТЯ (с ! по 15), сбнарух!енные с помощью П1(Р-скрали!гга в клонах а — е, обозначены знаком плюс (+). Буянами 1. и К указаны ЯТЯ, находящихся на 5 - и 3 -концах вставки (на ее левом и нравом концах соответственно). Б. Идентифицировав псрекрывакхпиеся учаспси, можно г!остроить контиг из пяти клонов и каргу расположения ЯТЯ. Полученные данные нс позволякл установить порядок некоторых из них (номера в скобках).
Интервалы между ЯТЯ нредсиалсны одинаковыми; в дсйствизсльности они неизвестны. 20 21 22 23 24 25 26 27 20 29 30 31 1 1 1 1 1 ! ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1„ 1 1 1 1 1 1 1 1 ! ! 1 1 1 1 ступающим концам рестрикционных фрагментов можно присоединять меченые липкеры. Для выявления перекрывающихся участков необходимо проанализировать очень большое число космидных клонов, поэтому для поиска меченых рестрикционных фрагментов, общих для пары клонов, используют специальные компьютерные программы. ДНК-отпечаток каждо- ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1. 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! ! ! Рис. 20.19. Картирование с помощью упорядоченных ЯТЯ (числа с 20 но 31 над горизонтальной линией). Точками указан ЯТЯ-состав клонов à — 1.
ЯТЯ упорялочсны, что позволяет без труда идентифицировать перекрывающиеся клоны. 1о клона сканируют, инфорлщцию вводят в компьютер и проводят попарные сравнения. По результатам этих сравнений организуют из клонов контиги. Наличие перекрывающихся участков в клонах созданного контига подтверждается построением подробных рестрикционных карт вставок.
Пробелы между контигами заполняют, выбирая зонды из ближайших концов соседних Молекулярная генетика человека 465 5' 3 — ССС 3' , — ССС 5 5' — ССТАС 3 — С 3' 5Р | 3'-эююззуклсазная аК»явность 3 -экюнуклсээная актиннссть 3'-экзсиукясээиая активность дС'ГР Пал»гнераэняя активность | астр Полгзмсраэная активность дСТР" Пслимсраэняя акгиянссть Рис. 20.20. Концевое мечсние двухпсночечных ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4.
3 -экзонуклеаэная активность Днк-полимеразы катализирует отщспление 3'-концевых нуклсотилов фрагмсгпов Днк с тупыми концами (А), с выступающими 3'-концами (Б) или с выступающими 5'-концами (В). Отщепление происходит ло тех пор, пока на противоположной цени не экспонируется основание, комплсментарнос меченому дезоксирнбонуклеотиду. введенному в реакционную смесь (дСТР*); затем »включается» полнмеразная активность ДНК-полимсразы Е4, и к 3'-концу присоелинястся свззболгзый меченый дезоксирибоцукяеотид. Метка включается в оба конца фрагментов ДН К (на рисунке это не показагзо). Для мечен ил можно использовал ь лкзбой дсзоксирибонуклеотил. контигов и проводя скрининг библиотеки, со- держащей крупные вставки, для поиска целос- тающих участков ДНК.
ЭΠ— 5155 1ранекрипционнае киртиравание Клоны кДНК-библиотеки представлягот собой ДЕ!К-копии тех транскриптов экспрессирующихся генов, которые присутствовали в конкретной ткани в момент экстракции из нее мРНК. «Привязка» индивидуальных клонов кДНК к хромосомным районам создает предпосылки к выявлению возможных капдипатов на ролы щюв тех или иных заболеваний. Если анализ генетического сцепления показывает, что ген данного заболевания находится в той жс области хромосомы, что и кДНК-последовательность(ти), то можно проверитьэ не происхоцят ли данные клоны кДНК из гена этого заболева! гизг. Привязку кДНК-клонов и других типов нуклеотидных экспрессируемых последовательностеи к специфическим хромосомным районам называют транскрипционным картированием. Для построения транскрипционных карт использузот различные методы В одном из них ча- стично секвепируют отделыгые кДНК-клопы н на осзюве трапслированпой части каждой кДНК- вставки получают ВТВ.
Данный тип БАТЯ называют экспрессируемым ВТЯ (еВТВ). Для определения хромосомной локализации еВТЗ используют линии соматических гибридных клеток, которые содержат единственную хромосому человека (монохромосомные гибриды) или фрагменты конкретной хромосомы человека (делеционную панель). Для этого ДН К каждог о из мопохромосомных гибридов амплифицируют методом ПЦР с использованием ебТБ-п!займеров и идентифицируют ту хромосому, которая содержит данный еБТЗ. Затем методом ПЦ1"-амплификацип ДНК клеточных линий делеционной панели идентифицируют район хромосолзьг, в котором находится данный еЗТБ (рис.
20.21). Кроме того, внугригенные БТЗ можно нанести па существующие РЕ-карги. К 199б г. на всех аутосомах и Х-хромосомзе было картировано около 20 000 внугригенных БТБ человека. Помимо экспериментов по картированикз кДНК-клонов в хромосомных районах, в Институте исследования генома в Роквилле, Мэрилегщ (Тйе! вы!(цге 1ог бепогпе Кеэеагс!з) и других 4бб ГЛАВА гб Р Гз Н А В С 15 В 5 6 МаРкеР 'г,А-".,;.': Вт,,'',.'С,"',: ~~. ' ':е '" гр':: !-~ ' . Н,;!( ' '~: ..:; Район е + з ЧГВ-Ь ч г + ВТВ-Е '.ГГВ-е + 7 1О Рис.
20.21. Привязка маркера к специфическому хромосомному району с использованием делеционной панели гибридных клеток. А. Схематическое представление районов хромосомы. присутствуюших в монохромосомпом клеточном гибриде (А) и в клеточных линиях  — 3 делеционпой панели гибридных клеток. Районы (с 1 по 1О) опредсллются границами дслсций в хромосомах делеционной панели. Закрашенный прямоугольник — центро- мера каждой хромосомы. Б. Результаты ПЦР-амплифнкации ДНК гибрндных клеточных линий (А--)) с использованием ЯТЯ-маркеров (с ЯТа-а по ЯТа-е).
Наличие или отсутствие ПЦР-продукта указано знаком плюс илн минус соответственно. Данные о наличии или отсутствии ИЦР-продуктов кзеточных линий дслеционной панели с ЯТЯ-маркером используются для определения хромосомного района, в котором находится ЬТЬ. Например, ВТЯ-б отнесен к району 7, поскольку соотвстствукнпий П ЦР-продукт образустса при амплификации каждой клеточной линии делеционной панели, в которой присутствует район 7. Мслекулярная генетика человека 4б7 лабораториях приступили к реализации проекта по частичному секвенированию клонов кЫ1!К- библиотек всех органов и тканей человека. Одной из задач этой г1ро~ раммы является создание каталога коротких последователыюстей (150 — 300 пуклеот~шов) для каждого экспрессируемого гена человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
