Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 137
Текст из файла (страница 137)
К счастью, в геноме человека в большом количестве (>100 000) встречаются другие полиморфные локусы, содержащие простые повторяющиеся элементы из двух, трех или четырех пар нуклеотидов — короткие тандемные повторы (8Т)(, от англ. айоц (апг)еш гереагх), которые легко регистрируются с помощью цолимеразной цепной реакции (ПЦР). Оолимор4изм коротких таиделтых повторов По геному человека равномерно распределены примерно ! ОО 000 блоков динуклеотпдных повторов СА/Ст [(СА) (СТЯ (рис. 20.13)„содержащих оз. 1 до 40 повторяк1щихся СА/Ст-элементов. Любой такой блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов.
Для СА2'СТ-повтора принято обозначение (СА)„, где п — число СА-повторов. В геноме человека встречаются и другие динуклеотидные повторы !например, (АТ)„и т. д, !, а также три-((АТС), и т. д. ! и тетрануклеотилные 1(АТСС)„и т. д.!. Чтобы идентифицировать полиморфные 8ТК-локусы„нужно прежде всего провести скрининг |еномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно ! 000 п. и.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА)„-повторов обычно используют зонд, состоящий из ! 5 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирук~щие последовательности однокопийны- Пара ЧТК-прайиеров Х 2 3 6 7 ! !ара ЯТК-п77аймеров У ! 2 3 Аллель ! (СА)!з СА САС АСАСАСАС АС АСАС АСАС АСАСАСА С Т С ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС Т носаеаовалельность псслслоаательнисгь Рис.
20.15. Два К! К-аллсля. Олин из них (аллель 1) содержит повтор (СА)м„ другой (аллель 2) — (СА)„. Повторы в обоих случаях фланкированы одинаковыми уникальными последовател ьностя!ии. Аллеаь 2 (СА)!с СЯСАСАСАСАСАСАСАСАСА СТ СТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС ТС Т Уникальная псалелоаательноеть Уникальная последовательность Рис. 20.14. Типирование 5ТК-локусов. А. ДНК, полученную от разных индивидов (и = 7), амплифицировалн с помощью ПЦР, используя пару праймеров (Х), фланкирующих (СА).(СТ)-повтор.
Размер всех образовавшихся П ЦР-продуктов одинаков (дорожки 1-7), следовательно, одинакова и длина Б !'К. Суля по полученным данным, 5ТК-покус представлен только одним аллслем. Б. То же„что и на рпс. А, но с использованием другой пары праймеров (У) для лругого 5ТК-локуса. Образование лвух разных П ЦР-продуклов означает, <то 7дшный покус представлен двумя аллелями. Дорожки ! — 3 соответствуют амплифипированному фрагменту ДНК индивилов, ~ омозиготпмх по одному ВТК-аллелю, дорожки 4 и 5 -- амплпфипироваппому фрагменту ДНК гетерозиготных индивидов, несущих два разных 5ТК-аллеля, порожки б и 7 — амплифипированному фрагменту ДНК индивидов, гомози гол ныл по другому БТК-аллелго.
ми, проводят ! ибридизацню ш з(!и с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в генол3е один раз, то синтезиру7от пару комплементарных им праймеров и проводят амплификацию СА-повтора. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученной от большого числа индивидуумов. ПЦР-продукты, длина которых для удобства электрофоретического разделения выбирается примерно 200 и.
н., разделяют в полиакриламидном геле. Если длина амплифицированного таким образом сегмента ДНК одинакова для всех образцов ДНК, значит, повтор не полиморфен (рис. 20.14, А), и наоборот, если образуются йдол!екулярная генетика человека 455 ПЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному ЯТК (БТК-полиморфизм, 5ТКР) (рис. 20.14, Б). Различающиеся по длине СА-повторы данного покуса представлякп собой вплели (рис. 20.15). Такие вплели нередко встречаются с частотой 0,20 и даже больше.
К настоящему времени уже обнаружены тысячи ЯТКР-локусов. Для их обозначения используются те же правила, что и для ПДРФ-покусов. В то же время названия ВТК!'-праймеров часто отличаются от названий покусов. Многие 5ТКР- покусы были идентифицированы французскими исследователями при финансовой поддержке со стороны Фразцузской ассоциации по мышечным дистрофиям (Азвосгаггоп Ггаглча)ве соп!гс 1ез 456 ГЛАВА 20 Муора(Ь!ез), и это нашло свое отражение в том, что обозначения многих пар ВТКР-праймеров начинаются с аббревиатуры АГМ, после которой идет идентификационный номер (АГМ349хс5). Обозначение пары праймеров часто сопровождается обозначением соответствующего локуса [АГМ349хс5 (О352017)).
В настоящее время для картирования генома человека используются в основном не ПДРФ- локусы, а 5ТКР. В отличие от ПДРФ-зондов, которые необходимо клонировать в векторе, очищать и метить, в случае ВТКР-локусов нужна информация лишь о нуклеотидной последовательности пары цряймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных.
Кроме того, БТКР-локусы равномерно распределены в геноме человека; частоты АНТК-аллелей очень высоки, что обеспечивает высокук> гетерозиютность, а сами аллели без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации. Картированне локуса генетического заболевания в определенном районе хромосомьг Анализ родословных не позволяет установить хромосомную локализапн]о гена того или иного заболевания, если только этот ген не находится на Х-хромосоме. Однако можно исследовать сцепление между геном данного заболевания и полиморфными ПДРФ- или ВТКР-локусами, идентифицируя последние с помощьк~ соответствующих зондов.
Этот подход дает наилучший результат в том случае, когда заболевание имеет четкие симптомы, ею наследование носит однозначный характер и известна степень его пенетрантност и. Для анализа сцепления прежде всего берут пробы крови у членов нескольких семей, представленных двумя-тремя поколениями, либо у членов одной большой семьи, предстивленной несколькими поколениями, с данным генетическим заболеванием (при этом необходимо проинформировать всех испытуел1ых о целях анализа и получить их согласие). Клетки крови культивируют, что позволяет постоянно получать ДНК для дальнейших процедур без повторного забора крови.
Проводят генотипнровяние ДНК каждого индивида по нескольким поли- морфным маркерам. В некоторых исследованиях используют более 250 маркеров, представляющих разные участки всех аутосом. Для всех информативных семей для каждого иолиморфного локуса и локуса генетическою заболевания вычисляют двухточечный (двухлокусный) лодбялл. Если У > +3,00, то имеет место сцепление, при У < — 2,00 сцепление исключается. Для определения хромосомной локализапии гена, ответственного за доброкачественные семейные судороги новорожденных (ВГЬ!С, Ьеп)рт Ряпина! пеопа(я! соплц111опа), была изучена большая семья, представленная несколькими поколениями„члены которой страдали данным заболеванием (рис. 20.16).
Зто состояние проявляется приступами неконтролируемых подергиваний мыпщ лица, туловища, рук и ног в первые шесть месяцев жизни. Примерно в 90% случаев симптомы исчезают после 1 года. По-видимому, припадки не оказывакп влияния на неврологический и интеллектуальный статус. ВГЫС— редкое заболевание, которое имеет четкие клинические признаки, наследуется по аутосомнодоминангному типу и имеет высокую пенетрантность. В исследованной родословной, включаюгцей несколько поколений, два из всех протестированных полиморфных маркеров, О20В19 и 020620, бьщи сцеплены с локусом ВГ1х С (табл. 20.4; рис. 20.16).
Аллели локусов 1)20о!9 и 7)20о20 каждого генотипнрованного члена родословной, представленной па рис. 20.16„обозначены числами, расположенными одно над другим. Верхние числа соответствук>т аллелям локуса 020о 79, нижние — Ю20о20. Вертикальная черта разделяет аллели локусов одной хромосомы. С помогцью зонда О20э!9 бьшо выявлено!О аллелей ПДРФ-локуса, с помогцью зонда Г)20В20 — 2 аллеля.
В некоторых! 1ДРФ-локусах несколько сайтов узнавания для одной рестриктазы группируются на небольшом сегменте ДНК (примерно 20т. п. и.) н все вместе рассматриваются как один локус. Четыре близкорасположенных сайта для одной рестриктазь1 л1огут приводить к образованию 20 фрагментов разной длины, которые выявлякпся одним зондом. ВТКР-локусы также могут иметь более двух аллелей. Молекулярная генетика человека 457 ! 2 5 б 7 8 9 !О 3 4 6~14 3~3 3~3 8~6 8!9 8!!5 8!9 5 6 7 3 9 10 !! !2 !3 !4 15 16 17 13 19 20 21 ! 2 3 4 1П 8~8 6~4 9~!5 8~3 3~7 8!6 8!В 5!8 8)6 в~б 8)6 7~9 3~8 3~!4 3~!О 8~6 8)15 6~8 9(10 4 5 б 7 8 9 1О 11 !2 * ! 2 13 !4 !5 8 8(6 8)6 Рг 5~6 8~8 8(8 8!7 6!9 3!3 !4!3 ! 51! ! 3!б 8!6 7!8 8!6 3 1 2 3 8!в 8!в 318 Среди членов представленной на рис.
20.16 родословной в большинсгве случаев наблгодается косегрегация гаплотипа (8,2) с заболеванием; это позволлет предположить, что в данной семье локус ВГХС находится именно на хромосоме 8,2. Можно бьшо ожидать, что и индивиды И1- 18, 1Ч-4 и 1Ч-14, получившие от больного родителя хромосому (8,2), также будуг больны, однако это предположение не подтвердилось.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
