Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 139
Текст из файла (страница 139)
которые, по данным киртпрования, находятся на том же плече хромосомы, что и ген заболевания. Используют те же полходы, что и при вычислении двухточечного лод-балла при анализе сцепления. В данном случае локус гена заболевания произвольно размещают среди четырех упорядоченных покусов и вычисляют лод-балл для каждой позиции. В случае мультилокусного картирования лод-балл равен логарифму отношения 1) нероятности того, что ген заболевания занимает определенное положение на карте из четырех упорядоченных локусон, к 2) вероятности того, что ген заболевания нс сцеплен ни с одним из рассматриваемых полиморфных покусов.
Использование именно четырех полиморфных локусов обусловлено тем, что при большем их числе слишком силыю усложняются расчеты. Ген заболевания может располагаться до первого локуса, н разных областях между локусами или за последним локусом. Рассчитав лодбалл ши каждого положения гена, которое он может занимать в различных наборах из четырех локусон, выбирают максимальное его значение, цревышактщее +3,00; оно лает наиболее вероятную локштизацию данного гена. )тартироватттте с использованием радиационных гибридов Для картиронания с использованием радиационных гибрилов (РГ-картирования) не нужно собирать родословные и тенотипировать членов банки СЕРН-семей. В основе метода лежит работа с соматическими клетками и скрининг (с использованием ПЦР-зондон) клеточных линий, содержащих части (фрагменты) хромосом человека.
РГ-картирование целой хромосомы или какой-то ее области начинается с создания гибридной («телевик/грызун) клеточной линии, содержащей одну хромосому человека. Клеткц такой монохромосомной гибридной клеточной линии подвергают воздействию летальных доз ионизирующей радиации (рентгеновских или гамлта-лучей), в результате чего разрушакттся клеточные мембраны, инактивирукпстт ферменты, происходит фрагментация хромосом. Единицей измерения лозы ионизируютцего излучения, поглощенной биологическим обьектом, является рад (гад, от англ. шгйабоп аЬкогЬед доке). Один рад равен 0,01 Дж на 1 кт ткани или 100 эргам ни 1 г ткани.
Обычно клетки н культуре погибают при 3000 рид. Чем больше доза, тем более сильные повреждения возникают и тем меныпе размер образующихся фрагментов !51олекулнриан генетика человека 461 ДНК. При дозе !0 000 рад фрагменты слишком малы для РГ-картирования. Очень важным моментом при РГ-картировании является высвобождение и сохранение фрагментов ДНК человека, полученных после облучения. Чтобы решить эту задачу', проводят слияние Облученных (Лонорских) клеток с необлученными (реципиентными) клетками грузынов. Облученные клетки, слившиеся друг с другом или оставшиеся изолированными, не способны расти в культуре вследствие радиационных повреждений.
В свою очередь, реципиентные клетки, как слившиеся друг с другом, так и не сгуывшиеся, лишены селективного маркера, который присутствует в донорских клетках и обеспечивает их рост в культуральной среде, используемой для слияния. Следовательно, в данной среде будут пролиферировать лишь слившиеся клетки донор — реципиент, иесущис селективный маркер, при этом большинство фрагментов ДН К облученных клепж окажутся встроенными или транслоцированными на функциональные хромосомы реиипиентных клеток. Выжившие слившиеся клетки культивируют вместе до тех пор, пока не установятся отдельные клеточные линии — так называемые радиационные гибриды (РГ). Группу радиационных гибридов, полученных в резуаьтате одного эксперимента, называют панелью радистционных гибридов (РГ-панелью).
В ней в виде фрагментов хранится большая часть хромосомной ДН К человека, полученной из монохромосомной клеточной гибридной линии. ДНК каждого члена РГ-панели анализируют с помощью нескольких хромосомоспецифичиых ПЦР-зондов, многие из которых «узнакут» полиморфные участки. Однако полиморфизм как таковой не требуется для РГ-картнроваиия. Цель такого картирования — выяснить, присутствует ли данный участок хромосомы в клеточных линиях РГ-панели.
Следовательно„для скрининга можно использовать и ПЦР-праймеры, специфичные в отношении уникальных (однокопийных) последовательностей ДН К. Мономорфные П ЦР-илентифицируемые хромосомоспецифичные участки называют ДНК-маркирующими сайтами (Ятз, от англ. бег!иепсе таяаез) .Птеа). Все клеточные линии РГ-панели ировершот на наличие (+) или отсутствие ( — ) такого сайта (табл.
20.5), используя весь набор зондов, и гибриды, 7ацлици 20..5. Данные по сохранениго маркерон при РГ-картиронаииип Рг-пвпель Ивлнчне нлн олсузствне маркера А Ь В 1' Д Е Ж ! 2 3 5 6 7 Я !О " Намерз в буквы — рзлнацнонные гнбрнаы н ПИР-маркеры сгюпкгспл."нно. Знаки пллк н мнну* укаль|взкл наличие нлн олсугствнс маркерный сансов вланном разо»мненно»г гнбрвлс ДНК которых ис амплифицирустся, отбраковывают. Для эффективного РГ-картирования необходима панель примерно из 100 РГ, полученных из олной монохромосомной гибридной клеточной линии. Теоретическая основа РГ- и мейотического картирования весьма сходна. ь! ел1 ближе друт к другу на хромосоме находятся два участка, тем Выше ве)ЗОятнОсть ТОГО, с1тО Оба Они Окаж)'тся В одном фрат менте ДНК после облучения.
Точно так же, чем ближе друг к другу находятся сайты, тем с большей вероятностью они не разойдутся при мейотическом картировании в результате рекомбинации. Основные положения, на которых базируется РГ-картирование, состоят в следующем: 1) индуцированный облучением разрыв между двумя сайтамн не зависит от сохранения маркера; 2) сохранение фрагмента с одним маркером не зависит от сохранения любого другого фрагмента в этой же клетке.
Полученные для всех клеточных линии РГ- панели паттерны (паттерны сохранения, сигнатура) наличия (+) или отсутствия ( — ) каждого маркера используют для построения РГ-карты. ЛО71-балл рассчитывают как логарифм отношения вероятности получения конкретного паттерна сохранения двух сайтов к вероупности того, что при облучении эти сайты всегда разделяются разрывом. В отличие от мейотической рекомбинации, В для частоты радиационных разрьиюв принимает значения от 0 до 1; В = 0 462 ГЛАВА 20 означает, что два маркерных сайта нико~да пе разделянгтся при определенной дозе облучения„ т. е. они тесно сцеплены.
При 0 = 1 маркеры всегда разделяются при определенной дозе облучения, т. е. вообще не сцеплены. Если лол-балл равен или больше +3,00, можно с уверенностью говорить о сне~ пении двух маркеров. Разработаны компьютерные программы, позволякнцие упорядочивать сайты и определять расстояние между ними на РГ-карте. Рассгояние между сайтами на РГ-карте измеряется в так называемых сантирэях (сР). Поскольку размер фраглгентов обратно пропорционален дозе облучения, необходимо указывать дозу, при которой была получена данная РГ-панель и построена РГ-карга.
Например, расстояние а 1 ср„.,„в означает, 'и о при дозе 8000 рад между двумя маркерами ~ ~роисхолит разрыв в 1% случаев. Прямой связи между сантирэями и числом пар нуклеотидов не существует. Можно лишь сказать, что чем выше лоза в радах, тем меныпе физическое расстояние Лля конкретной величины в сантирэях. Например, расстояния в 1 сР„„„, ! ср,„а„, 1 ср„а, 1 сР „и ! сР а„а эквнвале~пцы примерно 50, 53, 62, 90 и 100 т.
и. н. соответственно. Меиотическое же (генетическое) картирование способно дифференцировать сайты, находящиеся на расстоянии друг от друга в лу паем случае 1 сМ, т. е. 1000 т. п. и. РГ- карты не только имеют более высокое разрешение, но и являются более полными, чем генетические. Кроме того, РГ-картирование проще мейотического в техническом плане, а новые сайты можно быстро включать в ранее ~юстроенную РГ-карту. К сожалению, РГ-картирояание не позволяет локализовать гены тех или иных заболеваний в специфических районах хромосомы. Несмотря на это при построении мультилокусных карт хромосом человека РГ- картирование, вероятно, вытеснит картировацие по сцепдению, основанное на генотипировании членов СЕРН-семей. Физическое картироааиие генома человека Генетические и РГ-карты указывают линейное расположение маркерных сайтов.
1'асстояния л~ежду сайтами измеряются в условных едини- цах. которые отражают частоту рекомбинации (сМ) или вероятность сохранения двух сайтов в одном радиациоггнол~ гибриде (сР). Эти единицы можно перевести (в некотором приближении) в единицы реальных физических расстояний — пары нуклеотилов, которые используются в физических картах. Физическая карта целой хромосомы или ее области лает непосредственное представление о расположении генов в ДНК, что облегчает нх идентификацию и характеристику и систематическое секвецирование хромосомной ДН К. Для построения физической карты необходимо прежле всего вьшелить из библиотеки геномной ДНК клоны, содержащие перекрывающиеся сегменты.
Исходя из данных о перекрывающихся участках и другой информации о положении клонов, можно реконструировать непрерывный ряд клонированных сегл1ентов какого-то района хромосомы, целой хромосомы или всего генома. Были получены упорядоченнгяе наборы смежных (сопг!8цоцз) клонов (контиги) па основе Ъ'АС-(уеасч апйейа) сЬгопюзоше, искусственная хромосома дрожжей), ВАС-(Ьасгепа) агйбба1 сйгошоаоп1е, искусственная хромосома бактерий), РАС-(ЬасгепорЬаае Р! агйбба1 сйгопзоаоше, искусственная хромосома бактериофага 1'1) и космилных библиотек ДНК человека. Отметим, что стратегия построения контигов из крупных фрагментов ДНК человека, содержащихся в гАС-, ВАС- или РАС-библиотеках, немного отличается от таковой лля Р1- или космилных контигов.
Построение контигов из )АС-, ВАС- и РА С-библиотек При построении физических карт тех илн иных районов хромосом или целых хромосом из геномных библиотек, содержащих крупные вставки ( гАС-, ВАС- или РАС-библиотек), наиболее приемлем метод картирования, основанный на использовании БТБ. ВТ8 — зто короткий однокопийный участок ДН К (примерно 100 — 300 п.
н.), который можно выявить при помощи П ЦР с использованием уникального набора праймеров. Для получения протяженного контига, охватывающего значительный участок хромосомы, требуется большое число БТ8, находящихся на расстоянии 50 — 100 т. п. н. лруготлруга.
Напри- Молекулярная генетика человека 463 мер, Шщ физического картирования хромосомы длиной примерно 200 миллионов пар нуклеотидов (м. и. и.) необходимо от 1500 до 3000 ВТ8. Для построения же достаточно точной физической карты всего генома человека их нужно по меньшей мере 30 000. Для создания ЗТВ бьши разработаны различные подходы. В одном из них ДНК из очищенного препарата одной хромосомы человека, изолированной при помощи проточной цитофотометрии, обрабатывают рестриктазой и клонируют в векторе, способном акцептировать небольшие (<1000 п. н.) фрагменты ДН К. Затем секвенируктг вставки из клонов, выбранных случайным образом, и отбрась шают те клоны, в которых вставки короче 100 п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
