Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 142
Текст из файла (страница 142)
Но ценен и отрицательный результат, поскольку он позволяет исключить ланный ген из числа Оп>отозванных за капкретное генетическое заболевание. Пози>(ионное карт ировиние Страте!ия позиционного картирования приме- няется в тех случаях, когда ничего не известно о продукте гена, ответствеппога за наслелствен- Выбор возможного белая-ка>о>ила>в Ряс. 20.24. Каплилатное картировапис.
Идсптификапия гсиа, осповаппая па анализе симптомов обусловленного ил! заболевания и соображений, какой из уже охарактсризованпых генов может прстспловать на роль искомого гена, 470 Г)!ЛВА 20 нос заболевание, и нет никаких генов-кандидатов (рис. 20.25). В нолобных случаях определяют хромосомную локализацию (позицию) гена заболевания и проводят его поиск, применяя различные инструменты и средства («охота за геном»). Езлагоприятгзой для позиционною картирова1гия является ситуация, когда у нескольких больных встречается хромосомная перестройка типа грапслокации или крупной делеции (>10 т.
и. и.). Предположив, что она затрагивает ген, ответственный за патологический фе ногин „при анализе сцепления используют только один специфический райоп хромосомы вместо того, чтобы проводить сканирование всего генома при помощи большого числа полиморфных маркеров. После локализации гена в конкретном районе хромосомы определяют его положение более точно и идентифицируют ближайшие фланкирующие маркеры, используя мультилокусное картирование с дополнительными полиморфными зонда- Генетическое заболевание К«ртиронанае с точностью до хромосомного еайта Выделение гсномнмх клонон, охватывающих картврованнмй сайт Иаензифззхация и анализ экэоиов раэнммв мстоламя Выделение «ДНК клона Гтгбор геномного клона Характеристика геномного клона Применение му гнвионного анализа Ряс.
20.25. Позиционное картированяс. Идентификация гена, пргаукт которого неизвестен, с помощью хромосомного каргирования и зондов, специфичных в отношении тесно сцсплснньгх маркеров. ми. Минимальное расстояние между картированными маркерными сай гамп, при котором их можно разграничить, а лучшем случае составляет 1 сМ, что соответствует примерно !О" и. и. На таком участке может уместиться а среднем от 20 до 50 генов. Задача позиционного картирования состоит в том, чтобы определить, какой именно из них ответствен за лаппое заболевание.
Из контига, охватывающего район хромосомы, содержащий ген заболевания, выбирают геномные клоны, которые включают фланкирующие маркеры и заключепный между пими участок ДНК. Если такой контиг отсутствует„то с помощью зондов, специфич~гых в отношении тесно сцепленных маркерцых сайтов, проводят скрипипг библиотек гецомных ДНК для выявления клонов, происходящих из того района, который содержит искомый ген. Между !986 и 1990 зт., когда метод «охоты за генами» человека еще только разрабатывался, для идентификации нужных геиомцых клопов использовали метод «прыжков по хромосоме> (рис. 20.2б) или метод «прогулки по хромосоме» (рис.
20.27). После создания гецомных библиотек, содержашгих крупные фрагменты ДНК человека, и контигов эти стратегии утратили свою актуальность. Независимо от того, как «именно получены нужные геномные клоны, важно знать, какие из в Рас. 20.26. Создание библиотеки методом «прыжков по хромосоме». Проводят частя шый гидролиз геномной ДНК рестриктаэой, делагошей небольшое число разрывов, я вьшеляют фрагменты длиной примерно 200 т. и.
и. Спгивают их с геном вирд(-7 т. и. н.) я замыкают в кольпо. Буквами Л и В, Х а У, Ь я Т обозначены сайты, исходно находящиеся друг от друга на расстоянии 200 т. и. н.„но после циклизации фраз.- мснтон раздсленныс 7 т. и. н. Кольцевые молекулы, содержащие мпожсспзо сайтов для Есой1, обрабатывают этой рсстриктаэой, в реэульташ чего среди прочих образуются фрагменты, содержащие ген эир7' я фланкирукнцис его последовательности (Л и В„Х и 'т' Я я Т). Из всех фрагментон отбирают лиизь тс, длила которых составляет примсрио 20 т.
и. и., и встраивают ял в вектор на основе фаза Х Векторы, пссушяе ген тар7, будуз ампляфицироваться в Вирр -клстках-хозяевах. Идентифицируют клон, гибридизуюшийся с зондом, специфичным в отношепии исходной последовательности (Л, Х, В), затем субклонирукзт сто; при этом та его часть, которая не гибряляэустся с зондом, солержат участок ДНК (В, з', Т), находящийся ца расстоянии 200 т.
и. и. от исхолной послеловательиости. Модекулярная генетика человека 471 | Частичный гз~дролиз; вьглслснис Фрагментов длиной 200 т. н. и у В Геном нав ЛН К В Х ~'Ф вЂ” — 200 т. и. н.— ЗЧ | Лигнрованис с геном зиад (:; -) В Х Никлизанил Х | Клонирование в 2-гекторе В Плазмида — ск::н исав Субк сон ированис в а звзмидс Плазмида д / 472 ГЛАВА 20 Зоил ! Субклои Клон ! «прогулочной» библиотеки Зонд 2 Субклои '$.,::~, .'~' Клон 2 «прогулочной» библиотеки Зоил 3 (~.:,.„:...) ) Субхлон 1 40т.и.н.
2 О т. и. н. 3 : тП«,. Клон 3 «прогулочной» библиотеки «Прогулка» от по«лоло»лтехьности 1 до последовательности 4 них илн из субклонов содержат зкзоны. Для этого можно использовать целый ряд прямых и косненных методов, таких как идентификация СрС-островков, межвидовой Саузерн-блоттинг, отбор гибридон, улавливание экзонов, секвенирование ДНК, компьютерный поиск. Транскрнбируемым участкам геномов позвоночных часто предшествуют кластеры нуклеотидов, богатые остатками С и С (СрО-остров- Рис. 20.27. Прогулкапо хромосоме» А. Зонд 1 гнбридизухуг с клопированным фрагментом ДНК длиной 40 т. и. и. После субкчонирования и построения рестрикционной карты иоследовательностгч дисильную ио отношеншо к гнбридизовавшейся, используют для создания зонда 2.
Б. Прн помощи зонда 2 из библиотеки ныбирают другой клон !отличный от клона 1) и используют последовательность, днстальную по отношени!о к гнбриднзовавшейся с ним, для созлання зонда 3. Клоны ! н 2 вместе составлягот примерно ЗО т. п. н. 1за вычетом перекрывающегося участка — зонд 2 — между ними).
В. Проводят манипуллцни, аналогичные А и Б, используя зонд 3. Третий клон «про!улочной» библиотеки позволяет продвинуться по хромосоме еще на 40 т. п. н. Д Три перекрывагощнхся фрагмен!н ДНК охватывают примерно !20 т. и. н. хромосомной ДНК. «Прогулку» по хромосоме можно совершать в двух напранлоннях, руководствуясь при этом рестрикционной каргой. кн).
Группу СрО-островков можно идентифицировать по скоплению на рестрикционной карте сайгон для рестрицирующих эндонуклеаз Вал!, ВззП и БасП. Если как минимум два таких сайта отделены 5 — 10 т. и. н. друг от друга, значит, они находятся в пределах СрС-островка. Это не гарантирует, что именно здесь находится экзон, но указывает на наличие где-то поблизости транскрибируемого гена. Молекулярная генетика человека 473 Геномные клоны или субклоны можно гибридизовать по Саузерну с рестрицировапной геномной ДНК различных позвоночных, например с ДНК мыши, крысы, кролика, обезьяны, коровы, цыпленка, рыбы (зооблот, межвидовой блоттинг, блоттинг «Ноев ковчег»).
Положительная перекрестная гибридизация означает, что данный клон с большой вероятностью содержит кодируюшие последовательности, поскольку многие экзоны в ходе эволюции пе изменялись, в то время как повторяющисся и некодирующие послеловательности ДНК, в том числе и иптроны, претерпели существенные изменения. Положительный зооблот означает, что клон содержит экзон(ы), однако не показывает, есть ли в нем ген искомого заболевания.
Отбор гибридов позволяет быстро и с высокой эффективностью идентифицироватыеномный клон, содержащий экзон(ы), и одновременно изолировать соответствующую кДНК. Отбор можно проводить разными способами Обычно ДНК геномпого клона из той области хромосомы, которая содержит ген заболевания, фиксируют на твердой полложке, проводгп прегибридизацию с повторяющимися последователыюстями ДНК, а затем гибридизуют с линейными векторными молекулами со вставками из кДНК-библиотеки, происходящей из ткани, вероятнее всего экспрессирующей ген-мишень. Негибридизовавшиеся векторные молекулы смывают с фильтра, а гибридизовавшиеся элюируют и амплифицируют методом ПЦР„используя праймеры из векторных последовательностей, фланкирующих кДНК-вспгвку (рис. 20.28). Если точно неизвестно, в какой ткани экспрессируется ген-мишень, то кДНК-библиотеки разных тканей объединяют и проводят гибридизацию с отдельными геномными клонами.
ЛЦР-продукт можно затем клонировать и тестировать, с тем чтобы проверить, содержит ли он кодирующую часть гена данного заболевания. Для этого можно секвенировать кДНК и провести компьютерное сравнение нуклеотидных последовательностей этой ДНК и известных генов. Если будет получена высокая степень гомологии, можно сделать определенные выводы о том, какого типа белок кодирует данная кДНК, и если этот белок таков, гто его с высокой вероятностью можно считать продуктом ге- на-мишени, то данный(е) клон(ы) секвенируют и идентифицируют экзоны, интроны и 5 —, 3'- фланкирующие области.
АльтернативпьГй подход состоит в поиске мутаций с целью вьивления нуклеотидных различий между ДНК Денатуряцияднк головне~о клоня и фиксация ес ня твердой подложке | Г ибрвдиэация с членами КГ[НК-библиотеки Зл юлия гибрндизоваяшсйся кДНК Р! Лмплификация кДНК Рис. 20.28. Отбор гибридов.
Гибридизацией с ДНК геномиого ююиа «отлавлива1оГ» кДН К-ююн, амплифицируют его, клоиируют и тестируют. ч74 ГЛАВА 20 Эхзсн 1 Иптроя Эхзоя 2 Всхтор Р Псхихцг'хер ~ трацсфсхция, транскрипция Г!ерничцыятраисхрицт Процессирсазнный грзнскгапг | Обратная транскрипция Псрязя цепь хДНК | Синтез ДН К нз первой цсц я хДН К Гяятсз Д! !К нз Р! -Г1раймирояацной пепи Р2 ПЦР ПЦР-цеоаухг Рис. 20.29. Улавливание экзонов. А. Вектор для улавливания экзоноа содержит искусственный ген, состоящий яз промотора р, двух экзонов, разделенных интроном, который несет полилинкер, и сайта тсрминацни транскрипции !. После введения вектора в эукарнотическую клетку искусственный ген транскрябярусгся я нз первично!отраяскрипта удаляется цитрон.
Дхя получения ПЦР-продукта опрсдсленнойдлины, который содержит часть обоих экхзнов, используют ПЦР-амплификацию обратного транскрипта. больных и здоровых индивидов. Если подход, основанный на определении степени гомалогии нуклеотидных последовательностей, оказывается безуспешным, то секвенируют и анализируют другие гены из данной области. Реально при поиске гена-мишени для зкономии времени и средств характеризуют в первом приближении сразу несколько генов, пока не найдут наиболес вероятный ген-кандидат, который исследуют летально, в том числе с помо!пью мутапионного анализа. Улавливание экзонов («поимка» экзонов, экзонная амилификаГГия) — это метод, позволяющий идентифицировать и клонировать экзоны, находящиеся в субклонах, полученных из геномных клонов !рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
