Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 149
Текст из файла (страница 149)
В описываемом случае пациентке уладили около 15% печени, гепатоциты поместили я культуральную среду и ввели н них ДНК рекомбинантного ретроаируса, содержащую кДНК ЛПНП-рецептора. Затем осуществили инфузию транслупирояанных гепатоиитов а печень пациентки, где они прижились, экспрессирояали кДНК ЛПНП-рецептора и вырабатывали функциональный рецептор как минимум 18 мес. Если брать за основу показатели содержания липилоа, то состояние пациентки значительно улу длилось.
Более того, в ее арпшизме не образовывались антитела к ЛПНП-рецептору. Генная терапия ех ч)чо основана на трансплантации генетически модифицированных клеток, производящих терапевтический белок. Использование собственных клеток пациента предотвращает их отторжение, но ограничивает сферу прилгенения генной терапии ех Ичо. Так, число клеток ткани-мишени может быть недостаточна для их извлечения н культивирования 1и И!го, некоторые соматические клетки неэффективно поглощают ДНК, а экспрессия клонированного гена иногда оказывается временной.
Поэтому в настоящее время разрабатывают системы, которые зашищакп неаутологичные (ксеиогенные, аллогенные) клетки от иммунного 492 П! АВА 21 ° ° Создание «пакувп(ей» клеточной линии и ее иепользование длп производетва хелпер-независимого дефектного ретровируеа К. Мали, Е. С. Мцй(йап, 13. Ва(йпюге Сед 33: 153- 159, 1983 врсждает кле.гкв и нередко приводит к их злокачественной трансформации. Нанболес значимым достижением на пути практическои реализации генной терапии стала разработка системы для упаковки «зераневтическнх» генов в инфекпионззыс вирусные частицы, сохранившие способ|юсть прикрепляться к клеткам-хозяевам.
Манн и др. сконструировали первую клеточную линию для упаковки ретровирусов. Для это~о онн встроили вирусный геном с предварительно удаленной нуклеогидпой послсдоватсльпоспю, ответсгвенной за упаковку, в хромосому иле«очной линии, которая в этих условиях производит нсинфскционные вирусные частицы. После зрансфекции этих клеток ДНК- ко~ ~с ~ рук ци ей, которая содержала последовательность, необхолимую для упаковки, и терапевтический геп, но не содержала ретровирусные гены, а зьгинат-поли-1 -дтззин-ильз нггат, згоззизфнрсульфон, поли(акрнлоннтрил-ко-ниннлхлорид).
Доклинические испытания, провеленные щ ч1ю и на модельных животных, показали, что инкапсулиронапныс рекомбннантцыс клетки мозут пролиферпровать и ллитсльное время произволизь большие количестна рекомбипантного белка. Чтобы попытаться предотвратить гибель мотонсйронов, гзриволяпгую к нейролегенератинному заболеванию боковому амиотрофнческому склерозу, бзяла проведена 1 фаза клинических испытаний с использованием инкапсулированных клеток, вырабатывающих цилиарпый нейротрофический фактор (Сг4 г Р, от англ, а!~агу пегзгоггорИс уастгзг). Ироцедуа была признана безопасной, но у пациен гов с боковым ответа и позволяют высвобождать «терапевтический» белок. Неаутологичная генная терапия ех 9(чо включает выделение тканеспецифичных клеток, хорошо растущих в культуре (папример, фнбробластов или кератиноцитон кожи, астроцитов мозга, гспатоцитон или миобластов), и нх генетическую модификацию с помозцью «терапентическозо» гена.
Рекомбинаптные клетки заключают в искусственную полупроницасмую полимерную мембрану, через которую ныходит рекомбинантный белок и посту1 1ают в клетки питательные нещестна. Мембрана неиммуногенна и це вызывает сенсибнлизации пациента и отторжения имплаптнрованных клеток.
В качестве нцкапсулирук>- щего материала используют разные полимеры: Вопрос о применении генов терапии всегда вызывал споры, но большюштво ученых со ласны с Т. Фрилманом и Р. Роблином, которые еше в 1972 г. (Яс!елее 175: 949 — 955) писали: «Мы считаем, что гснав терапия сможю облегчить симптомы некоторых наследственных заболевании шловска, поэтому необходимо продолжать исследования, направленные на се развизие.» Ключевые моменты генной терапии — адресная лосзавка «терапевтического» гена и обеспечение его экспрессии в определенных клетках или тканях. Сначала в качестве основнозо средства поставки «терапевтических» генов рассмазривали векторы, полученные па основе вирусов человека. Это было связано с наличием у них механизмов проникновения в специфические клетки.
Наиболее многообегдакзн1нми считали векторы на основе ретровирусов. Но нативный рстровпрус — это изм фекционный агент, который по- она упаковывалась в вирусные частицы, которые затем использовали для доставки «терапевтического» гена в нужньп клезкзь Этот подход был принят на вооружение другими исследовазелями, занимающимися гсннои терапией. Спустя несколько лет исходную «пакуюшую» клеточную линию адаптировали и лля других вирусных векторов.
В 1985 г., имея в виду результаты Манна и лр.„У. Андерсон отметил: «В последнее время появились эг)х)юктивные системы доставки — экспрессии, которые нозволякгг сделать гсзшую терапию реальностью». А 22 мая 1989 г. Андерсон и с~о когшсги начали первое клиническое испьпапие по генной терапии. Прсдпринимавшиесл до недавнего времени поньпки генной терапии не отличались особым успехом, по полученная информация свилсз'ельсгвусз о том что в будущем опа сзанет вполне обычным методом лечения многих заболеваний. Генная терапия 493 амиотрофическим склерозом улучшения состояния не наблюда.к(сь. Г!ри имплантации инкапсулировы(ных С)'( ! Г-произвОЛ5!!цих клеток в мозг животных с химически инлуцированным повреждением, моделирующим лругое фатальное нейродегенеративное заболевание, хорею Гентинпопа, клетки мозга не разрушались.
Метоп инкапсуляции ю(сток, модифицированных с помощью генной инженерии, находится на ранней стадии развития, но может стать эффективным с(юсобом доставки терапевтических генных пролуктов при лечении многих заболеваний. Генная терапия 1и угуи Генная терапия ш И«о предполагает досшвку «терапепгическоюэ гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента (рпс.
2!35). Ретровирусцые векторы проникают только в делящиеся клетки-мишени, олнако во многих тка- »Т«ранен«пческнй» !«н, «по«обняв окспр«««прова(лсп 'а ' г«ии Рис. 21.6. Схематическое представление генной терапии ш И«о. Клонированный «герапевтическийэ ген (! ен Х) кодирует белок, корректиру(пшвй гепети (ескнй лефект. Этот ген доставляется к клегкам определенной ткани пациента с наследственным заболеванием н зкспрессируется в иих. Промотор р, под кошролем которого осуществляется транскрипция, ткапеснепифнчен. цях, на которые направлена генная терапия, большинство клеток не делится. Поз юму были разработаны разнообразные вирусные и невирусные векторные системы доставки «терапевтических» генов, учить(ваюшие большое число потенциальных тканей-мишеней (кожа, мышцы, легкие, мозг, толстая кишка, селезенка, печень, клетки крови) и расположение их в организме человека.
«ИЛеальнаяэ система доставки должна обеспечивать высокук! эффективность по(лощеция «терапевтическою» гена клетками- мишенями, минимальность его ннутриклето (- но(о разрушения при транспорте в ялро и попдержание уровня экспрессии, достаточного д;ш облегчения состояния больного. Вирусные системы доставки генов ретропаруслые векторы Опьп клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусцые векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Тем не менее безопасности их применения прололжают придавать большое значение.
Создана конструкция, называел(ая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены дал и ро), нахоляшиеся пол контролем 5 -П'В-промотора, а также «терапевтический» ! ен и ген етт управляемые пятов(е(то(овирусным промотором. После тра((сфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц, причем нероятпость рекомбинации с образованием компетентных по репликации ретровирусов очень мала. Вектор может переносить пе более 3.5 т. и. и. ДНК, нО и ллина бОльп(инства НОтенцигльных «терапевтическихэ кДНК и генов — супрессоров опухолей составляет 0,5 — 2 т.
п. н. В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовер(пенствовапия: увеличено число образующихся вирусных частиц„ повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в нелеляшиеся клетки, повьппена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинаптного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку лругого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр 494 ГЛАВА 2! инфицируемых им клезок. Зто явление называется фенотипическим смешиванием (рзеио/о(уре фогта/Гоп).
Фецотипически смешанный вирус получают с помо|пью котрапсфекции клеточной липни, которая синтезирует продукты генов «ад и ро/, рекомбинантным ретровирусным вектором и вектором, экспрессирукпцим ген епг пру~ого вируса. Изменяя геп епг, можно как сузить спектр инфицируемых вирусом клеток до строго определенного типа, так и распшрить его. Кроме тою, в ген епг ретровируса можно встроить нуклеотиднук> последовательность, кодирующую пептид, который связывается с опрелеленпым клеточным рецептором и обеспечивает внедрение рекомбинаптного ретровируся в нужные клетки. И наконец, мож1 ю добиться специфичности экспрессии терапевтического гена, осуществляя ее под контролем промотора, специфичного для определенных клеток.
Аг)еловируспые векторы Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки человека и широко используются в качестве живых вакцин, которые предотвращают респираторные инфекции и гастроэнтериты, не оказывая побочною действия. Зти свойсгва лелают яденовирусгя перспективными для доставки генов в клетки-мишени. Для получения ядеповирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей пролукты аденовирусного гена Е1, двумя участкал1и генома адецовируса (рис. 21.7). Один из них может сущестгювать в виде плазмиды в Е.
со// и содержит вместо Е1-области»терапевтический» гоп, флянкируелзый нуклеотилными гюслсдовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5'-концевого участка, вкзючаюп)его Е1-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей терапевтический геп плазмидой. Рекомбинация между лвумя трансфицирующимц фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного алецовирусного гена, в котором вместо Е1-области находится терапевтический ген. Пролукты гена Е1, гюсгавляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. Клонирукнцая емкость аленовирусного вектора составляет около 7,5 т. п.
н. В отсутствие рекомбинации трансфицирующие молекулы ДНК, обладающие недостаточной длиной, не могут упаковываться в вирусные частицы. Вероятность того, что межлу областью Е! в геноме клетки-хозяина и ДН К рекам бинантно го аденовируса произойдет рекомбинации с образованием компетентных по репликации вирусов, чрезвычайно мала. После того как рекомбгшантный аденовирус инфицирует клетку-мишень„его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия»терапевтического» гена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
