Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 152
Текст из файла (страница 152)
Активация предшественника лекарственного вещества («пролекарства») Несмотря на широкое применение хирургических методов лечения„лучевой н химиотерапии, злокачественные новск!бразовання по-прежне- Генная терапия 503 му остаются одной из основных причин смерти люлей, поэтому задача разработки новых способов их лечения является весьма акгуальной. Одним из таких способов является уничтожение пролиферирующих опухолевых клеток с помощью ганцикловира (ОСЧ; 9-(1,3-дигидрокси-2- цропоксиметил)гуанина) „активированного продукта гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (НЯ'Й).
Для этого проводят ш ч)чо трансдукпию или трансфекцию опухолевых клеток геном НЯ~гк, находящимся под контролем активного промотора, а через несколько дней вводят ганцикловир. Вирусная тимидинкипаза фосфорилирует ганцикловир с образованием ганцикловирмонофосфата.
Киназы клетки- хозяина почти не фосфорилируют ганцикловир, зато охотно присоединяют фосфатные группы к его монофосфату с образованием ганцикловиртрифосфата, который ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, вызывая гибель пролиферирующих клеток. Кроме того, через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат может проникать в нетрансфицированные опухолевые клетки, приводя и к их гибели. Одна экспрессирующая ген НзЧгА опухолевая клетка может уничтожить до 1О немодифицированных клеток.
Это явление называется «эффектом свидетеля». Ген, вызывающий при определенных условиях гибель собственной клетки, называют геном «салюубийства», а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вегцества, которая активируется с помощью другого компонента терапевтической системы. Разработаны и другие комбинации «пролекарство»вЂ” ген-активатор, но система ОСЧ вЂ” НЗЧгх используется чаще других.
,эффективность системы ОСЧ вЂ” НЯМ доказана целым рядом доклинических испытаний. Однако 1 Фаза ее клинических испытаний, в которых участвовали больные с терминальной стадией рака, не показала регресса опухоли. Возможно, ген Н Я~И был трансдуцирован в слишком малое число опухолевых клеток и„несмотря на «эффект свидетеля», не мог подавить рост опухоли. В настоящее время разрабатываются новые подходы„которые смогут повысить частоту трансдукции и доставить ген НВЧгх в клетки по всему объему опухоли.
Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использукяцие лвс разные системы генов. В одном из них сочетаются С)СЧ вЂ” НЯМ-терапия и генная иммупотерапия (рис. 21.12). Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном НЯЧЖ, другую клонированной кДНК (или генол1) одного из питокинов. Цитокины (интерлейкин-2, интер- лейкин-12 и другие) играют роль си~ нала, мобилизующего клетки иммунной системы и стимулирующего иммунный ответ. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помани ю гена «самоубийства», взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию.
Кроме то~о, противоопухолевые антитела, 1юступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов. Этот подход к генной терапии рака был проверен экспериментально: в печень животных имплантировали клетки рака толстой кишки, раздельно трансдуцированные генами НЯМ одного из цитокинов.
Введение ганцикловира останавливало рост опухоли в печени. Опухоль не возникала и при введении нетрансдуцированных опухолевых клеток в другие ткани такого жи~ютного. У контрольных животных в аналогичных условиях происходило развитие опухолей во всех местах введения нетрансдуцированных клеток рака толстой кишки. Несмотря на столь многообещающие результаты, прежде чем приступать к клиническим испытаниям терапии с использованием гена «самоубийства» или различных комбинаций генной терапии, необходимо установить, какие опухоли будут поддаваться такому лечению и не вызовет ли оно побочных эффектов. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов В большинстве протоколов генной терапии ех ч)чо и ш ч(чо используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональну|о форму белка, который нс синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме.
Однако многие заболевания 504 ГЛАВА 21 пухов«вы« !сткн нэвж Цнгохнновый ген Ганггнклоннр р © иммунной снсгсмы Рвс. 2!Д2. Комбинированный г!олход с использованием ОСУ-НВИгг-терапии и генной нммунотерапин. Онухолевыс клетки траисдуцировалн !н Муо геном тиындинкиназы вируса простого герпсса (Нбугх) и цитокиновъач !'споы. Гранслугвц!Огминыс кл!.Тки !я!уходи, которые синтезируют питокнп (1!ит). привлекают ныыунныс кле! ки, а те, которые синтезируют тнмидннкнпазу ГГК). фосфорилируют ганвиковнр, гросфорилироваиный гаггцикловнр проникает через межклсточпыс контакхы (чсрпыс прямоугольники) в соседние клетки н, связываясь с ДНК, уничтожает их (Х).
человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработан ь! терапевтические системы с использованием олигонуклеотидов. Неболыцой олигонуклеотид может п«бридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «анти- генным», а тот, который гибридизуется с соответствующей мРНК, — «антисмысловым».
Снизить уровень транскрипции и трансляции гена-мишени лгожет также олигонуклеотид, который связывается с фактором транскрипции, контролирующим экспрессию специфического гена. Для предотвращения активации транскри! !- ции специфических генов можно использовать и двухпепочечные олигонуклеотиды, присоединяк!щиеся к ДНК-связывающим белкам. Можно создать также синтетические молекулы ДНК, которые присоединяются к специфическим белкам-мишеням, исходно не являющимся ДНК- связываю!цими, и тем самым блокируют их функционирование. Наконец, лля уменьшения количества определенной мРНК и синтезируемого на ней белка можно модифицировать рибозимы — природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими молекулами РНК и разрезают их.
В будущем лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главныл! обьектом научных исследований и клинических испытаний будут «антисмысловые» последовательности и особенно — «анти- смысловые» олигонуклеотиды. Синтез «аилгисмысловьт» м Рг! К гп у!!го «Антисмысловая» РНК, которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, должна связываться с определенной мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка„подавляя тем самым патологический процесс (рис. 21.13). Для получения таких РН К использовали экспрессирующие векторы, несу- щие ДНК-вставки в такой ориентации, чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНК.
В качестве примера можно привести эписомные экспрессирующие векторы, в которые встроены кДНК инсулиноподобного фактора роста 1 (!ОР-!) или его рецептора Генная терапия 505 »чь«:;. Л п,,й,, -«, '» НК Транскрищ1ия |пп«|.ли А 2« —; — «а ф:.',„,.-...'З Первичный Е-': †""'-З транскринт Процсссинг РНК Комплекс мРНК вЂ” «антисмыюювая» РНК Трансллц»и блокирована Р !".~й:„','ойя:::";.""., г.":: сд. А -,:,,:,-:. ДНК «Антисмьюлоной» ол~гонуклсотил Первичный траискрипт инг РНК л»РНК «г:,::;,,:,",:, «2,;:,-.„';'»«й и,: Комплекс мРНК вЂ” »антисмысловая» РНК Трансляция блокирована Рис.
2! ЛЗ. Ипгибированис трансляции специфических мРНК с помощью «антисмысловых» нуклеиновых кислот. А. кДНК встраивают в зкспрессирующий вектор в обратной ориентации и полученную генетическую конструкцию вволят в клетки, где происходит синтез «антисмысловой» РНК. Эта РН К гибридизустся с мРНК-мишенью и блокирует трансляцию. Б, В клетку вводят аптисмысловой олигонуклеотил, который гибрилизуется с мРНК-мишенью и блокирует трансляцию.
Обозначения: р — промотор, рп — сигнал полинденилирования, А— интрон, 1 и 2 — зкзоны. 506 !ЛАВА 2! ((ОГ-! К), находящиеся в обратной ориентации под контролем металлотионеиноного промотора, активируемого «.пЗО . 1ОГ-1 вырабатывается в избыточном количестне клетками злокачественной глиомы, наиболее распространенной опухоли ~оловного мозга, а 1С!Г-1К вЂ” клетками карциномы предстательной железы. Вектор, обусловливающий синтез «антисмысловой» мРНК 1С!Г-1, трансфицировали в культуру клеток глиомы.
Если АБО в культуральпой среде отсутствовал, то гиперпродукция !С!Г-1 опухолью сохранялась, если же в среду добавляли ЪЮО«, то она исчезала. В другом эксперименте изучали последствия введения крысам цетрапсфицированных клеток глиомы и клеток, трансфицировацных «антисмысловой» кДНК !ОГ-1.
В первом случае опухоли развивались, а во втором — нет. Если клетки карциномы предстательной железы крыс, трансфицированные «антисмысловой» кДНК 1С)Г-1К, вводили мышам, то у них образовывались лишь небольшие опухоли или не образовывались совсем. Если же им вводили нетрансфицированные нли трансфицнронанные нормальной кДНК 1С)Г-1К клетки, то развивались опухоли болылого размера. По-видимому, в обоих случаях «антисмысловая» РНК гнбридизуется с комплементарной ей мРНК и ингибирует трансляцию 1ОГ-1 и 1ОГ-1К, предотвращая пролиферацию опухолевых клеток. «Аптпаиысловые» олигвяуклеотиды как лекарственные средства Терапевтический эффект синтетических «интисмысловых» олигонуклеотидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к лейстнию кчеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку.
15 — 20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культургя клеток, синтезирующих мРНК-мишею . Для это~ о проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включиют радиоактивную метку но время трансляции, и с помощью радиоантографии устанавливают, н присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотндов снижается синтез определенного белка.
Никаких общих критериен выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотилы, комплементарные 5'- или 3'-концам мРНК, границам экзонов и интронон и даже двухцепочечным областям. Олигодезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратилн способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным обризом пиримилиновые основания и лезоксирибозу (рис.
21.!4). Так„у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмыслоных» олигонуклеогидон свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфогруппу (рис. 21.14, Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотилы растворяются н воде, несуг отрицательный заряд и не расщепляются под действием энлонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК вЂ” ДНК-дуплексы, которые актинируют рибонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляюший м!'НК в гибрилной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов — лекарственных средств «первого поколения».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
