Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 154
Текст из файла (страница 154)
Но для того чтобы химерные олигонуклеотиды стали эффективными лекарственными средствами, необходимы дополнительные исследования. Если мутация в интроне распознается системой процессинга РНК как аутентичный сайт сплайсинга, то в процессиронанную мРНК включается часть интрона (рис. 2!.17, А). Это приводит к сдан!у рамки считывания и образованило укороченного белка. При этом количество нормального белка снижается, что может стать причиной заболевания. Разумно предположит!а что если «антисмысловой» олигонуклеотид, комплементарный мутантному интрону, плбридизуется с ним, то ошибочный сплайсинг блокируется, что повысит вероятность сплайсинга в нормальном сайте. Это предположение проверили на !)-глобиновом гене с мутацией во Коррекция генетических дефектов с помощью олигонукдеотидов Многие генетичесюле дефекты можно скорректировать, заменив связанную с данным дефектом пару нуклеотидов в мутантном гене на «пранильную» пару.
В одном из экспериментон тцля этой цели использовюГся 68-членный химерный (ДНК-РНК) олигонуклеотид, который образует шпильку с двумя головками и содержит метилированный кислород нри 2 -углеродном атоме рнбозы (рнс. 21.16). Выбор такого необычного олигонуклеотида основывается на следующих экспериментальных данных: 1) Гетеродуплексы РН К-ДНК легче, чем двухцепочечные ДНК, спаринаются с гомологичными нуклеиноными последовательностями; 2) го- Поедедеваледьность-машень х «ь ь 0 г 3' 5' Химерный оаяоалукдеотяд Рис. 21дб.
Исправление генетического дефекла, состоящего в замене одной пары нуклеотидов, с помощью химерного олигонуюГеотяаа. Стрелкой указаны мутантный сайт в последоаалельностя-мишени и нормальная пара оснований в химерном олигонукдеотяде. Соответетвукяцие нуклеотиды подчеркнуты.
Прописными буквами обозначены дезокеирнбонуклеотнды, а строчными — рибонуклеотиды. Жирным шрифтом выделены нуклеотиды, образующие соловки шпильки. Вертикальная черта указывает 3'- и 5'-концы химерного олигонуклеотида. (Из работы лооп е! а!., Ргег. дГаГ! Аеаа..уеь Г/Х4 93: 207! — 2076, !996, с изменениями.) 5!О !7!АВА 2! л » «синг РНК Бз ж г | Ш АС Б2 Преп«скин~ РНК ЗАКЛЮЧЕНИЕ втором интроне (рис. 21.17, Б), обусловлива!ошей одну из форм 1)-талассемии, наследственного заболевания крови, которое приводит к разрушению эритроцитов (анемии). В клетки, гомозиготные по мутантному гену (1»52-б54), ввели содержащий тиофосфатные связи «анти- смысловой» 2 =О-метилолигонуклеотид, комплементарный мутантному сайту сплайсингш В результате число нормальных !)-глобинов!ях цепей увеличилось на 50%.
Дальнейшие исследования покажут„является ли этот подход поста- точно эффективным для лечения талассемии и других состояний„вызванных подобными мутациями. Для многих наслелственных заболеваний никаких достаточно эффективных способов лечения не существует, и во многом это связано с трудностями получения и адресной доставки соответствующего генного продукта. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных ге- Рис. 2!.
! 7. Коррекция лефе кта, при водя щс| о к ошибочному сплайсингу, с помощью «анти- смыслового» олигоцуклеотида. А. Результат иупщии, приволящей к ошибочному сплайсингу. Обозначения: цифры — зкзоны, А— первый инт!юн, Б — второй янтрои, содержащий мутацию (красный кружок), разделяющую его падве части (Б! и Б2). Штриховые линии охватывают сегменты РНК, вырезаемые при процессингс.
Возможны лва варианта сплайсиига: вариант а приволит к образованию функциональной мРНК, вариант б — к образованию РНК„включающей часть второго ив»рона (Б2). Б. «Антисмысловой» олигонуклеотид (АС), связывающийся с мутантным сайтом сгщайсиига, препятствует его распознаванию при про1!сесин~с, и в результате образуется только функционгшьиая мРНК. нов (часто в виде кДНК) были предприняты попытки использовать их лля коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на молекулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ех ъг«о и генная терапия ш у!уо. При генной терапии ех г!чо «терапевтический» ген переносят в изолированные клетки больного с помозцью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту.
При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоя!цеи и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех юко использует генноинженернук> модифика цию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению «терапевтического» ~ енного продукта. При генной терапии !и т!то «терапевтический» ген вводят непосредственно в клетки ткани-мишени больного. Для это!о разработаны разные системы доставки: вирусные (ретрови- Генная терапия 51! русные, аденовирусные, аленоассоциированные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса) и невирусные (инъекция чистой ДНК, бомбардировка ткани-мишени частицами, конъкхгированными с ДНК, захват клетками ДНК, заключенной в лицидную оболочку).
Кроме того, разработаны вирусные и невирусные системы доставки генов, специфичные лля определенных клеток Весьма перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. При этом наиболее широко используется подход, включая)щий последовательное введение в оцухолевые клетки гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (Н8Ъ'г)г) и ганцикловира.
В результате образуется ганцикловиртрифосфат, токсичный для бьютроделящихся клеток. 1! огибают и нетрансформированные клетки, контактирующие с Н8Уггг-модифицированными клетками (вэффект свидетеляя). В качестве лекарственных средств можно использовать не только генные продукты, но и олигонуклеотиды. С помощью так называемых яантисмысловых» олигонуклеотидов можно подавить гголноспю или частично экспрессию гена того или иного наследственного заболевания. В одном из вариантов такой терапии клонированный ген встраивают в экспрессируюший вектор в обратной ориентации, в результате чего образуется комплементарный нормальной мРНК ДНК-транскрипт, который спаривается с ней и ингибирует трансляцию.
В более распространенном варианте введенный в клетку-мишень «антисмысловой» олнгонуклеотил гибридизуется со специфической мРНК и блокирует ее трансляцию. Эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов и время их жизни повышаются в результате модификаций, затрагивающих фосфодиэфирну|о связь, пиримилины и остатки сахаров. В настоящее время изучается терапевтическое действие различных олигонуклеотидов: модифицированных с помощью генной инженерии рибозимов, расщепляющих специфические мРНК; аптамеров, которые связываются со специфическими белками и бпокнруигт их функции; олигонуклеотидов, с помощью которых можно корректировать замену одной нуклеотидной пары и мутации, ириводацие к неправильному сплайсингу.
Л ИТЕРАТУРА Адгаиа! В. (ей) 1996. Алгйелье Лги ареигп в Ншпапа Ргеьь 1пс., Тогохха, 1'~. 3. А(Паап В. 1993. Е!х!Л ельке-йгесьед депе гйегару. Ргос. Аагй Аггху. Асй ЮА 90: 10898 — 10900. Аппегьоп ЪУ. Р. 1992. Нищал депе 1Ьегару. Лс!елее 256: 808-813. В1аеье В.
М., К. ЪУ. Сп!гег, А. 1). М111ег, С. В. Саггег, Т. Р)е)ьйег, М. С)еле!, б. Яжагег, ! . СЬапд, Ъ'. СИапд, Р. То)ьйпйег, Л. Л. бгеепЬ)а11, В. А. Воьепйегд, Н. К)еш, М. Вегдег, С.А. Мпйеп, ЪУ. Л. Ва~пьеу, 1,. Мпп(, К. А. Могдап, Ъу. Г. Апдегьоп. 1995. Т 1утрйосу1е-йгес1ег) депе 1Ьегару 1ог ЛОЛ 8С1бч шйга1 гг)а! геьц1)ь айег 4 уеагь. ЛЬ!елсг 270: 475-480. Вогйдпоп С., 1. В. 1Х1о(атаиде!о, !Х!. ГхоЬ|11, б. Ееггап', б. Саьогаг), Р.
Рап1па, Е. Магхо)аг(, О. Мадд)оп(, С. Коьь(, Р. Яегхыа, А. б. ()дагло, Р. Маг!11о. !995. бене Гйегару !и репр!хега! Ь(оог! 1ушрйосугеь апг( Ьопе шаггохг Гог ЛГ)Л !шптцподебс(епг райеппс ос!елее 270: 470 — 475. Вгеайег В. В. 1997. Г)(ЧЛ епхутпеь. гЪаг. В(огесйлой 15: 427-431. Впг(е)пй Р., С. 1..
СЬеппс)гу, Р. В)п(пь)апп', Л. Пап, Л. Пап. 1996. Лпгрьепье К!х1Л го Гйе гуре! !пьц11п1рйе дговгЬ 1асгог гесергог ьцрргеььеь гшвог дгоххГЬ апд ргехепгь !пгаяоп Ьу пп ргоьгще сапсег се!!ь ш гио. Ргос. !уигб Асад. Зсб ~УЛА 93: 7263-7268. Сар1еп Гч. Л., Е. ЪЪ'. Р. Ъу.
А!1оп, Р. б. МЬ(щегол, Л. В. 1)ог)п, В.Л. Вгегепмяй Х. бао, Я. К. Г)пгйаш, К. Ле(Гагу, М. Г. Нодьоп, С. Сов!еде, 1. Нпапд, Р. Л. Роггепь, В. ЪУ!111ащьоп, П. М. бейпеь. 1995. 'г3роьоше-птейагеб СВАХЕ депе ггапь1ег го 1Ье паза! ерйЬе1плл оГ раг(егзгь хг11Ь сулю ВЬгоыь. Наг. Мег). 1: 39 — 46. Со)е-Ягапьь А., К. Ъоов, Ъ'. Х(апд, В. С. Втуле, М. С. К(се, Л. бгуп, ЪУ. К. Нойогпап, Е. В. Кппес. 1996. Соггесг!г>п оГ Гйе пнааг)оп геьропь(Ь(е 1ог ысИе се1! апеппа Ьу ап К)х!Л-ГлчЛ ойдоппс!еойде.
ос(елее 273: ! 386 — 1389. Согпеца К., К. А. Могдап, ЪЪ'. Г. Азв!егьоп. !99!. даГегу !ььцеь ге!атей го гетгохйга1-шегйа!ег! депе ггапьГег )п Ьцшапь. 7(игл. бель 7!кег. 2: 5 — 14. Сгуьда! В. б. 1995. Тгапь(ег оГдепеь 1о!тошапь: еаг!у 1еььопь апг) обь1ас!еь !о ьцссеьь. 5счйлсе 270: 404 — 4!О. 512 ГЛАВА 21 Сп)чег К. %., Р. %. Апдегьоп, К. М. В!аеье. 1991. ).ушрЬосуте депе тЬегару. Нит.
Селе Птег. 2: 107- !09. Сп)чег К. %.„У.. Каш, Я. %айЬПдде, Н. )ьЬИ, Е. Н. ОЫйе!д, К. М. В)аеье. ) 992. 1п ччо ттапьчет в11Ь тетточ)та) честит-ртодисет сейь 1ог тгеатшепт оГ ехревшепта! Ьташ тишогь. Бпепсе 256т 1550-1552. Е)йпд)оп А. Р., К. Сопгад. 1995. Лртатпегь аь ротепйа! пис1етс асЫ рЬапвасеийса)ь. ВтотесГтпод Аппо. Лев 1т 1д5 — 2!4. ЕтпеПсЬ Р. Р., 8. К.
%тип, Р. М. Наптгауе, М. РеьсйапьЫ, Е.- т'. СЬеп, т'. СЬп, Р. МсРегтпо11, Е. Е. Вае)де, Л. Н. Когдовег. 1997. Ргосесйче е1Тест оГ епсарьи1атед се))ь ртодисшд пеито1гор)дс Гассог С)хТР ш а шоп)сеу пюс1е! оГ Нипйпдтоп'ь дЫеаье. Лтатиге 386т 395 — 399. Репдег Р., К. %. Н. Кп)дго1с, Е. Сои!, Б. ВЫТе1, Л. СЬгоЬосаеЬ. 1997. Лдепоч)тиь додесаЬедгоп, а пев чессог 1ог Ьитпап депе ттапьГег.
Лтат. Втотес)слой 15т 52 — 56. ИоВе Т. К., В. Л. Саг)ег. 1995. Асано-аььос)атед ч)псь частота 1ог депе тЬетару. бепе 77сег. 2т 357 — 362. бгоьяпап М., Я. Е. Карег, К. Коаагьйу, Е. А. Яе)п, Л. Р. Епде)йагдт, Р. Мийег, Р. Л. Еиртеп, Л. М. %Иьоп. 1994. 5иссеььГи! ех ичо депе )йетару сйгессед то йчег ш а райепт чдтЬ Гапнйа! ЬуретсЬо!еяето)пенна.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
