Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 151
Текст из файла (страница 151)
Однако ло начаша 1 фазы клинических испытаний НЯЧ-векторов необходимо провести дополнительные исследования. Невирусные системы доставки генов В опосредованной вирусами доставке генов участвуют клеточные рецепторы, с помощью которых вектор проникает в клетку-мишень, не разрушаясь лизосомными ферментами, и векторная Генная терапия 499 НЗЧ-смоляков-яяязмяяе Вирус-яомошняк НЗЪ' си НВЧ' Т( Сюявя уявш»вки НЯЧ Клетка-хозяин Упаковка, сборке, вьквобожяеяяе НЗЧ-еектор Ктет кв-мишень ДНК попадает в ядро. Однако вирусные векторы имеют ряд недостатков: опи Лорогостоящи н часто обладиот ограниченной клонирующей емкостью, что не позволяет ревулировать зкспрессиго «терапевтического> гена с помощью тканеспецифичных последовательностей.
Кроме того, вирусные белки могут вызывать носпалительную реакцию, что исключает повторное авепенис вектора. Позтолту бьши разработаны ненирусные системы доставки генов. Рис. 21.9. Вектор па основе НЬЧ- ампликон-ш|азмнды. Точка инициации репликации НВЧ (ом НВЧ), сигнал упаковки НВЧ и «терапевтический» ген (ТГ) встраивают в плазмплу Е.
сод (НБЧ-ампликонплазмида). Проводят трансФекцию клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помощником НВЧ, полученной плвзмидой. ДНК алцшикон-плазмиды реплицируется по типу «катящегося кольца», (О ампликонои, соответствующих полноразмерному геному НВЧ, упаковываются в НВЧ-капсил, который поставляет вирус-помощник НВЧ.
Геном этого вируса це упаковывается. НБЧ-частицы, несущие множество копий' «шрапевтического» гена, высвобождаются прн лизисс клетки и используются лля трапсдукции нейронов. Салтая простая из них — прямое явепенне ДНК-конструкций о клетки ткани-мишени. Ес ли в скслетную мыпгцу мыши ннъецировать плазмидную ДНК, то она проникнет я некоторое числа клеток, о чем свидетельствует экспрессия гена-репортера а течение по крайней мере 50 суг. Олнако применение этого подхола ограничивается тем, что не все ткани доступны для инъекций, а кроме того, нужны большие количества ДНК. Можно бомбарлнроаать с помо- Нлазмнла ДНК НКЧ Фрагмент ЛНК НВЧ ТГ Фрагмент | ДНК НКЧ Трансфекцня грансфекция Кдезка-хозяин вка, мление НВЧ дикою тина НБЧ-векзор 500 ГЛАВА 21 | Выделение рекомбинантного ! 1ВЧ Рис.
21.10. Образование НБЧ-вектора с помощью рекомбинации. Проводят котрансфекцик) клетки-хозяина плазмидой, которая содержит «терапевтическийв ген, флапкированный последовательностями ДНК из вспомогательных областей НЗЧ-генома, и ДНК НБЧ ликого типа. НВЧ-геном реплицируется в клеточнолг ядре по типу вкатвщегося кольцав, при атом между фрагмен гамп ДНК НЯЧ, вхоляшими в состав плазмиды, и ДНК НВЧ дикого типа лшжет произойти рекомбинация (штриховая линия). Молекулы ДНК НВЧ ликого типа и рекомбинантного НБЧ упаковываются в вирусные частицы, высвобождающиеся из клетки после ливиса.
Вирусы размножают и проводят скриниш бляшек лля идентификации рекомбинаптных НЯ'. Полученные НЬЧ-векторы хранят в условиях, исключающих их загрязнение НЯ' дикого типа. Генная терапия 50! Шью генного «ружья» клетки кожи или — через надрез — клетки подкожной опухоли конъюгированными с ДНК частипами золота диаметром 1 — 3 мкм.
Введенные таким образом «терапевтические» гены экспрессируются в тканях-мишенях, а их пролукты поступают в кровь. Это может облегчить доставку терапевтического белка в ткань-мишень, прямой доступ к которой затруднен. Однако большинство белков, в норме не присутствующих в крови, ипактивируются или разрушаются ее компнентаыи. Для решения этой проблемы нужны лополнительные исследования. Проникновение ДН К через клеточную мембрану можно облет ~яхта окружив генетическую конструкцию искусственной липидной оболочкой, образующей липидную сферу (липосому) с водным содержимым. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, например катионные липосомы, поверхность которых заряжена положительно; они связываются с отрицательно заряженной молекулой ДНК.
образуя ДНК-липидцый комплекс (липоплекс). Липоплексы легко образуются, относительно нетоксичны и неиммуногенны, но эффективность переноса генов с их помощью невысока, поскольку большая часть ДН К после попадания в клетку захватывается лизосомами и разрушается.
Так, в одном из клинических испытаний по генной терапии муковиспилоза с использованием комплекса липосома — Сг ТЛ-ген частота трансфекции клеток назального эпителия оказалась довольно низкой, а экспрессия гена — непродолжительной. Для поставки в клетки крупных генетических конструкций (>10 т. и. н.) с помощью эндосомного клеточного транспорза, позволяющего избежать лизосомного разрушения ДНК, образуют ко1гью~ат ДНК с другими молекулами.
Для этого поли-1.-лизин ковалентно сшивакп с молекулой, связываюшейся со специфическим клеточным рецептором, а затем добавляют ДНК. В результате получается компактная, плотно скрученная структура (тор), на внешней поверхности которой располагаются сайты связывания с клеточным рецегпором (рис. 2 !.1 !). К сожалению, подобный конъюгат, несмотря на свою специфичность, обладает низкой эффективностью трансфекции. Все созданные к па- стоящему времени невирусные системы доставки имеют два основных недостатка: !) низкая частота трансфекции, не позволяющая постичь нужного терапевтического эффекта; 2) непродолжительное время экспрессии «терапевтического» гена, не обеспечиваюшее эффективного лечения.
Возможно, подходящим терапевтическим вектором станет искусственная хромосома человека. Это связано с: 1) возможностью включения в нее протяженных сегментов чужеродной ДНК вместе с полным набором ре~уляторных элементов для одного или нескольких «терапевтических» ~снов; 2) возможностью использования геномного варианта «терапевтического» гена, обеспечива|ошего высокую эффективность его экспрессии; 3) стабильностью «терапевтического» гена и его длительной экспрессией как в пролиферируюшей, так и в неделящейся клетке-мишени. Искусственная хромосома содержит три основных элемента: ко1шевые участки (теломеры), центромеру и точки инициации репликапии.
Свойства теломерных областей хромосом человека хорошо изучены, чего нельзя сказать о пентромерах и точках инициации репликации, и существовали опасения, что искусственную хромосому человека це удастся сконструировать, пока не будут лоскональпо изучены все ее элементы. Однако уже получены и поддерживаются в трансфицированной культуре клеток стабильные линейные искусственные хромосомы человека (мнкрохромосомы), состоящие из множества ДНК-повторов (длиной около ! и. и.
и.) центромерной обласги У-хро»1осомы, высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК и тело- мерных участков. В их центромерпую область был встроен ген устойчивости к неомипину, что позволило ис~юльзовать среду О4!8 в качестве селективной. В нескольких 0418-устойчивых клетках 6ьши обнаружены микрохромосомы длиной отбдо 10 м п.
н. Две из трех мнкрохромосом были получены «усечением» существующей хромосомы. В одном случае исходная центромера была сохранена, а в другом заменена трансфипированной центромерной областью. Третью, полностью искусственную микрохромосому получили лигированием !п»йгго трех трансфицированных 5б2 ГЛАВА 2! л ! 1оли-1.-лизян Ляг»ил ТГ днк Д!1хнюнъкзпп ДНК-элементов. Ясно, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей «терапевтический(е)» ген(ы), вполне реально, но основной проблемой станет доставка этой огромнон молекулы ДНК в ядро клетки-мишени.
Кроме того, экспрессия генов, входящих в состав ДНК.-блоков, из которых построена искусственная хромосома, может оказывать вредные воздействия на клетки-мишени. Для цачача в ткани пациента можно попытаться импланти- Рис. 2!.1!. Система доставки «терапевтических» генов с использояацием ДНК-конъюгата. А. К поли-ъ-лизину прищиваюг лиганд, соединяющийся с поверхностным клеточным рецептором, и лобавляют ДНК, содержащую «терапевтический» ген. В результате образуется ко)щеисированная структура, на поверхпосп! которой располагаются лиганлы.
Гк ДН К-копъзогат связывается со специфическим клеточным рецептором (!) и обволакивается клеточной мембраной (2) с образованием зпдосомы (3), которая защицгает его от лизосом. В знлосоме часть молекул ДИК высвобождается из копъюгата и проникает в ядро клетки (4), где и происходит экспрессия «терапевтического» гена. ровать инкапсулнрованньщ клетки с искусст- венпымн хромосомами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
