Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 153
Текст из файла (страница 153)
Ыипаецями являются РНК питомегалоннруса, вируса иммунодефицита человека, а также м Р НК генов, отнетственных за разнитие рака, болезней кишечника и лругих заболенаний. Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептилной! связями (рис. 2!.14, В и У). Такие молекулы очень устойчины к лействи|о нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2'-угле- родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотнды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 1.14, Д и Е). Все преимушества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Г! роникновепие «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчитгь поместив их в липосомы. Такая нысоко- 1'енная терапия 507 Л д ННз Й Н С вЂ” СввСН 3 Н Рве. 21.14. Модификации *антисмысловых» оли1онуклсотилов. А. Фосфодвэфирная связь. Ь'. Тиофосфатная связь. В. Фосфорамидитная связь. й Полиамидная связь (пептидная нуклеиновая кислота). Я.
2 -О-метилрибоза. Е. С-5-пропинилцитозин. эффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с сайтами связывания, специфичными для определенных клеток, то можно будет осуществлять адреснук1 доставку олигонуклеотидов. Проведенные доклинические испытания показали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекарственными средствами. Изучена возлюжность их применения лля лечения стеноза коронарных и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через б мес вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрепию межклеточного вегцества во внутренний слой артерии в месте ее расширения.
В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили «антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного цикла млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования.
Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами. «Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты 1 фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с полющью орального введения «антислзыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК- мишень кодировала межклеточный адгсзин типа 1, который вырабатывается в избытке у ~пациентов с болезнью Крона.
Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревмагоидного артрита, псориаза и язвенного калита. В принципе «антисмысловые» олигонуклеотидзя могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мип1енью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств. 508 ГЛАВА 21 Олигонуклеотиды, связываюи(г!есг! с белками: антитромбиновый аптамер Блокировать экспрессию гена-мишени можно не только с гюмощью вантисмысловой» терапии, но и ввелением в клетку олигонуклеотида, связывающеюся с фактором транскриппии нли трансляции, однако этот подход пока недостаточно изучен.
Далее, поскольку нуклеиновые кислоты способны связывап ся с белками, можно синтезировать такой олигонуклеотид (так называемый аптамер), который будет присоединяться к определенному белку, в норме не связанному ни с какими нуклеиновыми кислотами, и блокировать его функцию. Так, антитромбиновый аптамер может стать недорогим средством профилактики громбообразования при различных хирургических вмешательствах. Для его получения использовали набор химически синтезированных олигонуклеотидов, состоящих из 18-нуклеотидных фланкирующих областей (праймеров) и центрального 60-нуклеотидного участка, где в кажлом из 60 положений может находиться любой из четырех нуклеотидов.
Теоретически такой набор содержит примерно 1,3 !Озв (4го) олигонуклеотидов с разной центральной последовательностью. Образец пропустили через колонку, содержа!дую связанные молекулы тромбина, присоединившиеся к тромбину олигонуклеотиды элюировал и и повторно пропустили через колонку со связанным тромбином. Эту процедуру повторяли не менее трех раз. Конечный набор тромбиновых аптамеров амплифицировали с помощью П!(Р и клонировали, после чего определили физические и биологические свойства каждого из них. Те аптамеры,которые обладали высокими сродстпом, спец!ифичностыо и антитромбиновой активностью, отбирали для более детального анализа.
Таким образом был получен эффективный антитромбиновый аптамер. К сожалению, вследствие малою времени жизни !и г(во его можно использовать только для временно!о ингибирования функции тромбина (например, при кардиопульмонарном !пунтировании), а в тех случаях, когда необходимо длительное введение противосвертыва!ощих веществ (например, при ангиопластике), он неприменим. Очевидно, что опи- санную процедуру идентификации аптамеров можно использовать и в случае других белков- мишеней. Рибозимы «ак лекарственные средства Рибозимы — это природные РНК, обладакппие каталитической акгивносгью (РН К-ферменты)1 их субстратсвязывающий домен присоединяется к комплемептарной РНК-мишени с помощью водородных и, возможно, других связей, а каталитический расщепляет ее в специфическом сайте.
Модифицируя субстратсвязывающую последовательность, можно получить рибозим, специфичный в отношении определенной мРНК (рис. 21. 15). Создание «терапевтического» рибозима— сложный процесс Связано это с трудностью получения болылих количеств синтетических Р! 1К и сохранения их в нативном состоянии в клетке- мишени. В одном из экспериментов синтезировали олигодезоксинуклеотид, который содержал каталитический домен (примерно 20 нуклеотидов) „ф лап кирова нн ый ги брид изующи мися с мРНК-мишенью последовательностями (они же выступш!и в роли праймеров), амплифнцировали его, встроили в эукариотический экспрессирующий вектор и трансфицировали полученной конструкцией клетки.
Образопввшийся после транскрипции рибозим расщеплял мРНК-ми- — 3' мРНК 3' ' , " 5' Г: Г, Рвбозвм Рис. 2!.!5. Расщепление мРИ К под действием рнбознма. Рибозим, субстратсвязывающнй домен которого модифицирован с помов!ыо генной инженерии, гибрндизуется с мРНК-мишенью в рапп!е1швет ее в специфическом свите (показано сгрелкой). (Из работы 1опе е! в1., рл Ию 7: 471 — 476, !993, с изменениями.) Генная терапия 509 шень и полавлял трансля ГГслю белка, ответственного за развитие того или иного заболевания.
Рибозимы, созданные методами генной инженерии, можно использовать лля лечения рака н вирусных инфекций. Природных ДН К-ферментон (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезированы олигодезоксинуклеотиды, обладающие каталитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их получения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно упаковать в липосомы и достанить в клетку-мишень. Однако создание эффективных ДНК-ферментов находится пока на начальном этапе развития.
ловки шпилек, не участвующие в спаривании, защищают олигонуклеотид от экзонуклеаз; 3) 2'-О-метилирование предотвращает разрушение молекулы РН Казой Н. Важно и расположение нуклеотидов в химерной молекуле: десять рибонуклеотидон фланкирулот пять центрюльных дезоксирибонуклеотидов, причем этот сегмент имеет одинаковую с мишенью последовательность и содержит нормальную пару нуклеотидов. Возможность коррекции мутаций с помощью химерных олигонуклеотидов изучали с использованием как кДН К, входящей в состав плазмиды, так и хромосоллной ДНК. В обоих случаях мутантньлй сайт с высокой частотой заменялся нормальным.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
