Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 55
Текст из файла (страница 55)
В библиотеке генов содержится вся наследственная информация организма. Однако определение того, какой именно из томов библиотеки (т.е. клонов) содержит необходимую в каждом конкретном случае информацию, представляет очень сложную для генетиков проблему. Если копия соответствующей генетической информации оказывается доступной в форме структуры молекулы РНК или в форме последовательности аминокислот, то это может быть использовано при отыскивании в библиотеке клона, содержащего требуемую информацию.
Такой поиск осуществляют следующим образом. Библиотеку фагов Х высевают на большую чашку Петри, так чтобы на чашке было приблизительно 10000 негативных колоний. Например, библиотека генома Ргозорй((а те1алодазгег умещается всего на четырех таких чашках. Каждая негативная колония содержит химерные инфекционные фаги н большое количество химерных молекул фаговой ДНК, не уместившихся в головки фатов. Эта свободная ДНК дает возможность определить, какие именно из негативных колоний содержат интересуюшие нас Организация и передача генетического материала А Рис.
9.15. Поиск в библиотеке генома тутового шелкопряца генов оболочки яйца На Рисунках (А) и 1Б) представлены две пленки, снятые с одной и той же чашки Петри, содержащей 5000 негативных колоний. Обе пленки выдерживачи некоторое время с меченной Рз' кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции из мРНК, выделенной из развивающихся ооцитов. Затем с пленок смывали остаток не всту- пившего в гибридизацию зонда, и подвергали ралиоавтографии. Черные пятнышки соответствуют не- гативным колониям, в которые включился радиоактивный зонд.
Сравнение пятнышек на двух экзем- плярах пленки позволяет отличить случайные «позитивы», проявившиеся лишь на одной из двух пленок. от истинных, проявившихся на обеих. фрагменты ДНК. К поверхности чашки Петри прикладывают специальную пленку, на которой отпечатываются все негативные колонии. Затем пленку снимают и помещают в раствор щелочи, денатурирующий ДНК. Пленку высушивают и выдерживают в вакууме при температуре 80 С, что приводит к установлению ковалентных связей между отпечатанными одноцепочечными молекулами ДНК и пленкой. На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е.
одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересуюший нас ген; это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном; наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК.
Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом )рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно вьщелить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК.
Труднее выделить из библиотеки клоны, соответствующие генам с известным фенотипическим проявлением, но неизвестным непосред- 9. Методы работы с ДНК отвеина биохимическим продуктом функционирования. Метод, с помощью которого зту задачу можно решить, был впервые предложен применительно к геному дрозофилы Бендером и Хогнессом и получил название «прогулки по хромосоме».
Этот метод требует, чтобы, вопервых, была заранее известна локализация интересуюшего нас гена на генетической карте политенной хромосомы (см. главу 5, например, рис, 5.19) и, во-вторых, чтобы для какого-нибудь гена той же хромосомы существовал зонд. Рассмотрим в качестве примера участок Х-хромосомы, изображенный на рис. 5.19, и будем двигагься по хромосоме, как это изображено на рис. 9.16. Наша цель состоит в том, чтобы отыскать в библиотеке клонируемые фрагменты ДНК, отвечающие гену диасе, локализованному в хромомере ЗР4. Этот ген необходим для ~(юрмирования нормальной памяти у мух; прн этом он также кодирует фермент сАМР- специфическую фосфодиэстеразу.
Прогулка по хромосоме начинается с рекомбннантного клона ).сРш1570, несущего ДНК нз хромомера ЗС11-12. Этот химерный фаг извлекается из библиотеки генов дрозофилы посредством гибридизации с информационной РНК, выделенной из слюнных желез личинок. Эта информационная РНК кодирует клейкий белок, обозначаемый символом Ядх-4. Генетическое картирование мутаций, затрагивающих 5дт4, позволяет локализовать этот ген в полосе 3011-!2 политенной хромосомы (рис. 9.16). Клонированная ДНК 5дх-4 гибридизирует с ДНК из полосы ЗС! 1-12 политенной хромосомы, расположенной непосредственно справа от левого края делеции 0) (1) с(- т~"'~. Это можно показать, используя разработанный Эдвином Саузерном метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку, связывающую одноцепочечные молекулы ДНК (блотннг по Саузерну; см.
рис. 9.6). Затем на эту пленку наносят радиоактивный зонд, что позволяет определить, какие из фрагментов ДНК в геле комплементариы последовательности нуклеотидов зонда. Этот метод схематически изображен на рис. 9.17. Используя метод Саузерна при сравнении нормальных мух и мух, в геноме которых имеются делеции, можно локализовать концы этих делеций, если использовать в качестве зонда клонируемую ДНК. О нарушении нормальной нуклеотидной последовательности в делетированной хромосоме свидетельствует изменение распределения сайтов рестрикции по сравнению с ДНК нормальной хромосомы. Например, если конец делеции находится между двумя сайтами рестрикции нормальной ДНК, то расстояние между оставшимся сайтом и следующим (внутри делеции) изменится, поскольку почти наверняка следующий сайт в делеции окажется на другом расстоянии от сохранившегося, чем был первый.
На рис. 9.18 показано использование метода Саузерна для определения нового распределения сайтов рестрикции. На рис. 9.1З, А представлены результаты опыта, в котором ДНК мух дикого типа (Огейоп-й) и 0((1)дт""«(0((1)Н'4пз подвергали действию Нис)111, а затем сравнивали методом Саузерна, используя в качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы из клона ).сРш2! 51. Обратите внимание на то, что распределение сайтов рестрикции в обеих ДНК одинаково, гак как ДНК дрозофилы из )сРш2! 5! комплементарна последовательности и нормальной ДНК, и ДНК из хромосомы с делецией 0)'(1)ат'"'э. (Обратите также внимание на то, что, как это видно на рнс. 9.16, в хромосоме с делецией О)'(1)1»'«4дз отсутствует 13456 1234 5 6 7 В9 1 2 34 123'56 7В1012 12 — 561243 5 67 В 1245 7В' 10 ВЛ«40 ВЛ гд зл З,г 4 73 В,О 95 !32255 551Л4Л ".КВ,.:, .; -,!! а 6,6 3,1 3515 6,9 1,1 12.5 2,03,4 3,0 5,9 1,6 йв„г' . 9,0 5106 104 47140В 62 фад:: !05,.1-3»ЧГ 2,9 7,6 3,3 Ваа 141 Пд з!.19 Рг ббп Рис.
9.1б. Карта рестрикции участка Х-хромосомы Ргазара110 те!аяадажег, полученная при анализе перекрываю- шихся фрагментов ДНК клонированных в харон-фагах 1. н отобранных методом «прогулки по хромосоме» слева направо, как это описано в тексте. На рисунке представ- 42 2,4 4-5, Д 5»11 Н.
ОЛ+ 0 2.1 5,0 В.б 0 2,0 В,5 1.1 9,3 Ега Ю зл 2,4 90,2 Зл 2,7 1,0 4,11,1 5Д 1.9 ЗЦ122 Ная Ш 1570 ХЮаа101 ', 106 лена карта участка протяженностью около 100000 н.п, Серыми полосами изображены концевые точки неко- торых из хромосомных перестроек; ширина полос соответствует точно- сти, с которой докализованы кон- цевые точки перестроек на рестрик- ционной карте. 285 9. Методы работы с ДНК Окраска геля Рестрикзция и электрофореэ в згзроэном геле Фотографирование Гель помешают на влзжную фнлыровапьную бумагу (межпу двумя пластиковыми проклзд- кзми) Нейтрализация (промывке геля в 1М грис, РН 5,5, 2МНзС1) Денатурзция фрагментов ДНК (промывка геля в спирте, 0,5 М ХзОН;!,5 М МзС1) Нз гель изклздмвзют иитроцеллюлозную пленку сверху помещают фильтровзльную'бумагу и прижимают грузом Фил Проклздки Фитиль Кювета с буфером, Стеклянная пластинка содержащим 2МНзС! рН 7,0 бтфеР поднимзетсЯ по филыРовзльиой бумаге, перенос» фрагменты дНК ДНК химически связывается с нитроцеллюлоэой при выдерживзнин прн температуре 80' С в течение двух часов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
