Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 52
Текст из файла (страница 52)
На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости реакции второго порядка, т.е. в соответствии с уравнением (2). Напротив, кривая ренатурации ДНК эукарнотического организма свидетельствует о том, что в процессе ренатурации величина /г, должна изменяться. Для того, чтобы интерпретиро- вать кривые ренатурации ДНК типа изображенной на рис. 9.4, следует предположить, что в ДНК эукариотических клеток присутствуют различные типы нуклеотидиых последовательностей, различающихся сложностью и частотой повторов.
Часть ДНК, ренатурнрующая медленнее всего (т.е. характеризующаяся наиболее высокими значениями с„гп,), отвечает уникальным последовательностям, представленным в геноме однократно. Фракции, ренатурируюшие более быстро, соответствуют семействам идентичных или очень близких последовательностей, каждая из которых характеризуется определенным значением константы скорости, отражающим сложность (М) семейства. Долю генома, занятую последовательностями того или ино1о тина, можно оценить по ординате графика, представленного на рис.
9.4. 9. Методы работы с ДНК 2б7 Таблица 9.1. Последовательности, узнаваемые некоторыми рестрикпионными зндоиукле- азами Число сексов узвевени» в вирупгом генома 91740 Л Аденовирус 2 Фермена микроорганизм Ем!ли аху!3 Еса81 5' С А А С Т Т Т Т СЗ' 1 5 5 А А С РнА СЗ' 7 34 >20 РуТ С лен рьа гну! е,а, К 16и бл и С Т РУ С А Рн СТТЗ' С А А Нмат 5'ААС Т Т С 6 6 11 С А А А А СЗ' Т Т С 5 11 6 2* 5' С С С С С С 3' 1 >50 >50 С Нра П 11 рыь курам ' С С 3' 18 >50 >50 С С На 1и Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрнцирующие эндонуклеазы !рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично.
Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотндов н, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. Рестриктазы второго типа узнают палинлромные последовательности -последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от осн симметрии. Рестриктазы третьего типа, напротив, узнают асимметричные сайты.
В табл. 9.1 представлены сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Как указано стрел- !в ' Звезвочквми помечены основвння, которые могут быть мсгнлироввны ферменгвмн моднфиквнни. Малыми сгреяквми указаны разрезы, производимые ресгрикгвзвми знпл и длнннвя вср. тика. юная анния — ось симметрии. Рп пурин, Ру — пирнмнднн. Размеры геномов: 5У40-5224 н.пс Л вЂ” 48502 н.пл иденовнрус 2-38200 н.п. Организация и передача генетического материала Таблица 9.2.
Характеристика сайтов, узнаваемых рестриктазамн Фермент Сейт узиевения Тин П (Р) = У) Е/с ! Снмметриеный (Р/ = б) Ве! 1 Вем Н! Вс! 1 Вй! П Есо Ш Н!и сШ1 Нрв( Крн 1 Ре! ! Рои П ймо 1 Яос ! бес П йс! 1 Х(и 1 Хйо 1 Асс 1 СТ ~ (А/С)(С/Т)АС С ! РуССРиС (АсТ) СС ( С С(Т/А) РиСССС ! Ру С(Т/А)СС(Т/А)(С СТРу ) РиАС Аоо 1 Нее 1 Нее П Нй! А! Н!и сШ Симметрнвнй (Р/ = 5) С ~С)ЧСС С)С(А/Т)СС ~ СС(А/Т)СС С ( АР(ТС Аеи 1 Аое П Есо Ю! Н!н Н Вырожденный симметрниеый (Р/ = б) ТСС)ССА С(САТСС Т! САТСА А ( САТСТ С( ААТТС А ( АССТГ СТТ)ААС ССТАС ! С СТССА! С САС ) СТС ССС)ССС САССТ) С СССС(СС С (ТССАС Т ( СТАСА СТС ~ САС 2б9 9, Методы работы с ДНК Продолжение табл. 9.2.
Сайт узнавания Фермент Симметричный (Х = 4) АС(СТ СС(СС СС(СС ССС(С С(ССС ! САТС Т! ССА А!и 1 р ()и Нае И( Нр И Мйо 1 те( Симметричный мегипироваиньш (Х = 4)" Прп! С АТС с( стс)сс Мяр 1 тур ш Асснметричньж (Х = 5) САССС(ЧХХХ(Ч~(3') СТСССМЧХ(Ч(ЧХЬПЧЫХ((5') ССТСА(чхьпчх(ч(чн((з') ССАСТНХХХУ(ый(5') СААСАХМ~ПЧМг((ЧМ(3') ст т ст (чн(чыныМ(5') Нуа 1 Нрй ! Мйа И ' для ферментов типа И последовательность представлена лишь в одной цепи; комплементарную последоватезьность можно достроить. Вертикальная пипия обозначает положение, в котором разрываются фосфодизфирпые связи. Звездочки указывают основания, которые могут быть метипированы соответствующими ферментами модификации. з Спедифический сайт узнавания Орп 1 содержит метилировапный аделин (~А), тогда как сайт МЬо 1 содержит неметилированное основание. Мзр 1 узнает указанную последовательность независимо от метилированности внутреннего С; Нра 11, напротив, узнает ту же последовательность лишь в том случае, если внутренний С не метилирован.
ками, точка разреза двойной спирали может совпадать с осью симметрии, а может быть сдвинута относительно нее. В последнем случае образуются комплементарные концы, и между соответствующими основаниями могут сперва устанавдиваться водородные связи, а затем посредством ДНК- лигазы происходить сшивка фрагментов с возникновением ковалентных связей между соседними нуклеотидами. Зашита от повторного расщепления рестриктазой обеспечивается ферментами модификации, метилирую- Организация и передача генетическоги материага шими некоторые основания в сайте узнавания: соответствующие основания помечены звездочкой.
Метилирование происходит после того, как соответствующий нуклеотид включается в ДНК в процессе репликации. Эти ферменты могут действовать либо на неметилированные, либо на полуметилированные сайты; при этом в процессе полуконсервативной репликации образуются полностью метилированные сайты. Из различных видов и штаммов бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной спирали ДНК.
В таблице 9.2 приведена их классификация. Функция некоторых из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клетки от присутствия чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они, по-видимому, не ограничивают проникновение чужеродной ДНК 1п Иго. Вероятно, эти ферменты осуществляют какие-то иные функции. Как бы то ни было, рестриктазы независимо от их функций 1п чгко служат мощным инструментом структурного анализа геиомов.
Рестрикционный анализ молекул ДНК Огромные возможности рестриктаз можно проиллюстрировать на следующем примере. Рассмотрим двухпепочечную репликативную форму бактериофага фХ174. Он содержит два ковалентно связанных комплементарных кольца, из 5386 нуклеотидов каждое.
Чистый препарат ДНК состоит из гомогенных молекул фага, Теперь представим себе, что этот препарат подвергается действию эндонуклеазы, однократно разрезающей двойную спираль кольца без какой-либо специфичности в отношении точки разреза. В результате мы получим препарат ДНК, содержащий линейные молекулы 5386 различных типов, т. е. препарат, совершенно бесполезный с точки зрения анализа нуклеотидных последовательностей. Напротив, если при этом используется рестриктаза Рзг 1, разрезающая палиндромную последовательность ОТССАО (выписана последовательность нуклеотцдов лишь в одной цепи двойной спирали), то получается гомогенный препарат линейных молекул ДНК длиной до 5386 нуклеотидов кажлая, упорядоченных в одной и той же последовательности.
Геном фХ174 содержит лишь один сайт, узнаваемый рестриктазой Рж1. В геноме фХ174 есть сайты, узнаваемые многими другими ферментами, перечисленными в табл. 9.1. Количество и локализация сайтов для каждой рестриктазы строго определены. Таким образом, воздействие каким-то ферментом приводит к образованию уже известного количества фрагментов ДНК фиксированного размера. Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее крупных. Так как фрагменты каждого типа характеризуются одинаковым размером и одинаковой последовательностью нуклеотидов, то нуклеотидную последовательность в каждом из них можно определять отдельно, иа выделенном посредством электрофореза в геле препарате.
Полную последовательность нуклеотидов в геноме можно затем «собрать» из последовательностей отдельных фрагментов, если знать последовательность самих фрагментов в геноме. 9. Методы работы с ДИК Рис. 9.б. Злектрофоре- тическнй анализ ре- стрикционных фрагмен- тов ДНК. ДНК фага "ь инкубироввли с раз- личными указанными на рисунке рестрикта- зами время, достаточ- ное для того, чтобы во всех чувствительных сайках произошло рас- щепление нуклеотидной последовательности.
Образовавшуюся смесь фрагментов ДНК под- вергали элекгрофорезу в агарозном геле. По- лосы идентифипирова- ли в ультрафиолето- вом свете после окра- шивания геля бро- мистым этиднем. Стар- товые точки обозна- чены жирными сгрел- Контроль Ага 1 Ага!1 Есо К1 — в Нгл дШ Нра! В81!1 й о. о -в т ками. Иитактная ДНК фага у. представляет собой линейную моле- кулу длиной около 48 500 н.п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
