Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 53
Текст из файла (страница 53)
При дей- ствии рестриктазы Вдй1 возникают фраг- менты длиной 22800, 13600, 9800, 2300 н.п. (они отмечены тонки- ми стрелками) и 4б0 н.п. [неразличим). Геном фага фХ174 принадлежит к числу самых мелких и наиболее хорошо изученных (см. гл. 7), н именно для этого генома в 1978 году бьша полностью определена последовательность нуклеотидов с помощью описанного выше подхода (см.
гл. 12). Фаг )ь также представляет собой хороший пример того, как можно использовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для описания структуры генома вируса. На рис. 9,6 можно видеть число и размеры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких различных рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов, образующихся при действии определенной рестриктазы, можно определить с помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении карты сайгон рестрикции генома фага Х.
На рис. 9.7 схематически изображена карта сайгон Его К! и Нт г)1П на фоне генетической н физической карт генома фага Х. Последовательность образующихся при рестрикции фрагментов в иптактной молекуле ДНК можно установить несколькими способами. Прежде всего можно использовать неполное расщепление ДНК эндонуклеазами к последующее разделение фрагментов электрофорезом. Затем Организае(ин и передача генетического лштериала 272 Рис. 9.7. А. Физическая А карта ДНК фага х, нв которой указаны сайты рестрикции для Есо В1 я Н(од1П.
Б. Размеры фрагментов, образую- итхся прн действии (!) НтдП1; (2) Есон! я (3) Нтд1Н а Есой1. (Мштау К., Миееау Н. о (!975). 1. Мо!. В!о!., 98, 55!.) 1 и г с, 3 ж 4 Р, 5 г з 45 б о иб Ре е1 (2 10 10 Эяектрофорез А ВС Р ЕЕ (1) ! ! ! ! ! А' В'С'Р'Е' Е' (г) ! ) (! ! (3) ! ()! ! )! ! А' 1111 Еиея че Р выделенные из электрофоретического геля крупные фрагменты снова подвергают действию того же фермента и посредством электрофореза устанавливают идентичность образующихся мелких фрагментов. С другой стороны, фрагменты, возникшие в результате полного расщепления под действием одного фермента, можно извлечь из геля, обработать второй рестриктазой н определить затем с помощью электрофореза размеры образовавшихся мелких фрагментов.
Так, например, из рис. 9.7 видно, что выделение фрагмента А под действием рестриктазы Нт д111 и последующая обработка Есо й1 приводят к образованию фрагментов А' и т, возникающих и при одновременном воздействии обоими ферментами. Сопоставление карты рестрикции с генетической картой можно осуществить, действуя рестриктазамн на ДНК, выделенную из различных мутантов фага )е с известными делецнями и перестройками в геноме. Сравнивая фрагменты ДНК фагов дикого типа и мутантных, можно определять участки генетической карты фага )ч в которой локализованы соответствующие фрагменты. Построение рестрикционной карты генома дает возможность разработать стратегию определения последовательности нуклеотидов в ~снах, представляющих особый интерес.
В результате действия нескольких различных ферментов образуются сравнительно мелкие перекрывающиеся фрагменты, содержащие не более нескольких сотен нуклеотидов. Эти фрагменты могут быть выделены в чистом виде, и в них может быть установлена последовательность нуклеотидов. Затем, зная взаимно перекрывающиеся участки последовательностей, можно восстановить последовательность нуклеотидов в крупных фрагментах и в геноме в целом. гуз 9. Методы работы с ДНК Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование) Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано несколько методов.
Во всех этих методах ферменты рестрикции используются для фиксации специфических «точек отсчета». Последовательность нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из !00-200 нуклеотидов. Более длинные последовательности составляются из коротких фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании комплементарной цепи проверяется правильность описания последовательности нуклеотидов в первой цепи. Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны иа создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, начинающихся в определенной точке и оканчивающихся определенным нуклеотидом, тогда как размеры фрагментов могут быть различны.
Каждый такой исходный набор фрагментов затем фракционируют по размерам посредством электрофюреза в геле. Фрагменты должны быть помечены радиоактивным изотопом, для того чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля. Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8. Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу выделения исходного набора фрагментов.
Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом "Р в 5'-конце с использованием (у — '~Р) АТР и фермента, называемого лолинуклеотидканаза. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь; звездочка обозначает радиоактивную метку з'Р на 5'-конце.
Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5'-конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце — определенный нуклеотид (см. рис, 9.8).
(При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми 3'-концами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле «бок о бок». Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис.
9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5'-конца (т.е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. Организация и передача генетического материала Рхсглеллснис ло 6 А !! с~~ С С А 6 с ~ Т Т А А 6 А о. о о о.
к сэ рис. 9.8. Основные принципы определения нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот. Меченные радиоактивным изотопом (*) фрагменты одноцепочечной ДНК подвергают химической обработке четырьмя различными методами, в результате чего образуются четыре группы фрагментов, в каждой из этих групп фрагменты слу- С А 6 С С С С А Т 6 6 Т Т А А 6 А т~ ~~ Т важа Получение исходных 6 ) ~ наборов рхдлохктивно ! меченных фрагментов о Рхаиоавй тографля х электро.н о форсгичсского геля выявляет в И различия в длине й фрхгмснтое и чайной длины оканчиваются определенным нуклеотидом.
Все четыре набора фракциони- руют затем по размерам посредством злек- трофореза. Нуклеотидная посчедовательность при этом может считываться непосредствен- но с радиоавтографа злектрофоретического геля (последовательность стрелок от полосы к полосе на диаграмме). ввв в вв А СА САА Т ТСС С Т ТСТСТТААСГСА ° вв ввв в в в АСА С А А ТТС С С Т ТСТСТТААСССА ввв А6АС ААТТСССТ ТСТСТТАА 666А ° вв АСАС АА ттссст 66СА ТСТСТТАА ° вв ввв ввв АСАСААТТСССТ ТС ТСТТА А С ССА вв в ° вв в вв ввв АСАСААТТСССТ ТС ТС Т ТА А С С С А ° вв ° вв рнс. 9ЛО. После образования водородных связей между комплементарными основаниями концы фрагментов соединяются ковалентными связями под действием лигазы. Если один из двух фрагментов ДНК, используемых прн конструировании химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например, плазмиду или зписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации.
Репликация такого репликона буде~ приводить к размножению также второго фрагмента, составляющего рекомбинантную молекулу. Исходный репликон становится при зтом вектором для другого фрагмента ДНК. В качестве таких вектороя для клонирования (или клонируюигих векторов) любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг Х н множество различных плазмид.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
