Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 56
Текст из файла (страница 56)
После этого нитроцеллюлознмй филыр готов к гибридизации с рзпиозктивнмм зондом Рис. 9Д7. Метод Саузериа. Молекулы ДНК ковалеитно связываются с плеихой, после чеобрабатывают рестриктазами и образовав- го пленку обрабатывают радиоактивным шиеся фрагменты подвергают электрофорезу зондом л подвергают радиоавтографии. в агарозном геле. Размеры рестрикционных Сравнение радиоавтографа с фотографией фрагментов определяют по фотографиям ге- окрашенного после электрофореза геля поля, окрашенного бромистым этидием.
Затем зволяет определить рестрикты, комплеменфрагмеиты денатурируют и переносят на тарные радиоактивному зонду. !йоде(диез Д. пленку из иитропеллюлозы с цомощью (... Та(1 й.С., ()п(ъегя1у о( Сай(огпци Г)ач(з.1 фильтровальной бумаги. Фрагменты ДНК участок ДНК вокруг полосы ЗС!1 — 1 2, так что анализируется лишь ДНК из хромосомы (г( ( Цс(т'зые.) Сравним теперь хе же фрагменты, используя в качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы клона ) сЛш1570, который имеет общий участок с ДНК клона )ьс(Зш21 51 (рис. 9.(б).
Распределение сайтов рестрикции прн эхом (рис. 9.!В,Б) получается совершенно иным. Фрагменты, образующиеся при рестрикции нормальной ДНК, теперь отсутствуют, и имеется лишь один фрагмент другого размера в ДНК хромосомы ()((!)с(т~~"~. Внимательное рассмотрение 28б Организация и передача генетического материала Н!и ПП! Нм сПП 5ас 1 2 П ицО кь кь ' ''Лгг $;з л()ес — 15.0 ;с.:,:,,',,", ',~~ — ы.о вв- — 5.9 — з.в — 3.4 — 2.9 1570 — 1.9 301!и 2151 1570 — — Теломера И вЂ” + з' Центромера — + 5.2 3.0 . 2,9 3.4 1.9 9.0 6.2 3.5 2 в Нн 41П 9.6 2.3 2.7 15.0 11.0 23 5ас 1 РП1) дт карты рестрикции, изображенной на рис. 9.18,В, показывает, что новый фрагмент, длиной примерно в 8,8 т.п.
н., должен представлять собой левую часть фрагмента длиной 9,0 т.п.н., идентифицируемого зондом ) сРщ1570. Следовательно, крайняя точка делеции Р)'(1)с)тззсгв должна располагаться внутри фрагмента 20Рга1570, причем неподалеку от правого конца участка длиной 9,0 т.п.н. фрагмента НтИ)1. После того как установлено, что ).-вектор, несущий участок ДНК из хромо- Рис. 9.18.
Локализация концов хромосомных перестроек на карте сайгон рестрикции ДНК. ДНК мух с генотипом Р(11)с)тгз"сз)Ря1) Хеспсз сравнивают с дНК мух дикого типа линии Огейоп-В. Сравнение проводят по методу Саузерна. Фрагменты рестрикции идентифицируют с помощью гибрилизации радиоактивной ДНК харон-фа- гов лсйт2! 51 и ХеЮт!570. В хромосоме РП1) Хе"л' полностью отсутствует ДНК из участка, содержащего ген 593-4 и, следова- тельно, все присутствующие в геноме фраг- менты ДНК принадлежа~ хромосоме Р(11)с)тззаз 287 9. Меиоды работы с ДИК Число независимо клонируемых случайно выбранных фрагментов ДНК, необходимое для того, чтобы составить библиотеку генома (иногда говорят ибанк генов»), зависит от размера генома организма и от величины клонируемых фрагментов ДНК.
Пусть )п' — число независимых клонов, составляюших библиотеку; Р-вероятность того, что данная нуклеотидная последовательность представлена в библиотеке; г.-средняя величина клонируемых фрагментов ДНК; Х-размер данной искомой нуклеотидной последовательности; М вЂ” размер генома. Тогда Это выражение' позволяет определить вероятность того, что в коллекции из Х клонов представлен ген величины Х. Обычно в качестве минимально приемлемого значения вероятности выбирается Р = 0,99 и разрабатывается состав реакционной смеси, гарантирующей получение числа независимых рекомбинантных векторов, превышающих данное Х. ' С!пгке 1...
Спгвоп Д (1976). Се!1, 9, 91-99. сомы дрозофилы, включает конец делеции )ЗА(17г)тг"", можно начать «прогулку по хромосоме». Делая первый шаг по хромосоме, мы используем радиоактивно меченный рестрикционный фрагмент ДНК дрозофилы в 2с)гш1570 в качестве зонда, позволяюшего отобрать в библиотеке генов дрозофилы другие фаги, гибридизируюшие с ним При этом оказывается, что существует общий участок у векторов ась)ш 1570 и 2сРш 2001 (рис.
9.16). Следующий шаг состоит в том, чтобы используя в качестве зонда радиоактивно меченный фрагмент рестрикции вектора 2сОш 2001, расположенный правяе участка, общего с вектором ).сРш 1570, выбрать из библиотеки новые фаги, гнбридизируюшие с ХсЛш2001. Таким способом нз библиотеки последовательностей отбирается набор фрагментов с общими участками; полученная таким образом коллекция рекомбинантных фагов дает расшифровку последовательности вправо от гена Ваз-4 (рис.
9.!6). Из карт сайтов рестрикции отдельно взятых клонируемых сегментов можно собрать карту участка хромосомы в целом. Для того чтобы в процессе такой «прогулки по хромосоме» следить, в какой именно точке мы находимся, следует использовать клонируемые зонды для локализации на карте рестрикции концевых точек других хромосомных перестроек (рнс. 9Л8). В результате такой процесс прогулки по хромосоме может быть спроецнрован на цнтологнческую карту, поскольку известны клоны, захватываюшие концевые точки делеций 1)у(ц)уппзм 7)((1)п4гмга и 2гу(1))сьыгп Дополнение 9,2. Сколь )йелика-:библиоТека генома? 288 Организачил и передача генетического лигтериала Обзор методов работы с ДНК «Прогулка по хромосоме»-это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждавшиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Сау'зерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК вЂ” дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотическнх организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей.
Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в наших знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах. Не удивительно, что новые эффективные методы исследований нашли применение не только в фундаментальных исследованиях. Они оказывают глубокое влияние на медицину, ветеринарию, селекцию животных, растений, на микробиологическую промышленность.
Приведем всего лишь несколько примеров. Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах. узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодируюшего )ьцепь гемоглобина человека; замена происходит в сайте (СТХАО), чувствительном к рестриктазе Же! (рис.
9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием !Эйе! у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помоп1ью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена ))-глобина, как это показано на рис. 9.!9. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу.
Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда сушествует подозрение, что оба родителя — носители вредного редессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазамн. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике. Новые методы работы с ДНК позволяют также значительно усовершенствовать методы создания вакцин против различных вирусных заболеваний человека н животных. Такие новые способы, включая клонирование и определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса, применяли при разработке вакцин против яшура-одной из наиболее распространенных в мире тяжелых болезней свиней и крупного рогатого скота.
Современные вакцины, приготовленные традиционным способом, используют «инактивированные» или ослабленные препараты, которые, однако, иногда содержат патогенные вирусы, что может приводить к вспышкам болезни. Кроме того, некоторые штаммы вирусов при культивировании в лабораторных условиях не достигают кон- 289 9. Методы работы с ДНК Нормальная ))-цепь Рю-С!6-С!ч ССТ САС САС ССА СТС СТС Сайт рестрикации )Ые 1 подчеркнут Серповидно- клеточная ))-цепь 7 — Ч ! — СЫ ССТ СТС САС ССАСАС СТС а о гз а К 175 376 56 57 рд д' р' 376 175 центраций, достаточно высоких для вакцинации. Разработка синтетических вакцин позволяет решить многие из зтнх проблем.
Основным антигеном вируса яшура является белок головки вируса ЧР1. Однако сам по себе этот белок, выделенный в очищенном состоянии из вирусных частиц, или полученный из клеток Е. со!1, используемых при клонировании гена )7Р!, обладает слабым антигеиным действием и не может использоваться в качестве вакцины. Определение нуклеотидной последовательности клонируемого гена позволяет, зная генетический код (см. главу 12), легко определить полную последовательность аминокислот и белке ЧР1. После того как полная последовательность аминокислот известна, нетрудно химически синтезировать более короткие полипептиды, обладающие сильными антигенными свойствами и индуцирующими синтез антител против целых вирусных частиц. Рис. 9.19. Исследование мутации серповидно- клеточной анемии на уровне ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
