Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 54
Текст из файла (страница 54)
Вектор с клонируемым фрагментом ДНК может проникнуть в клетку Е, сой после того, как клетка обработана ионами Са . Такая процедура позволяет конструировать щтаммы бактерий, несущих определенные фрагменты чужеродной ДНК (клоны), и размно- Рис. 9АО, Образование рекомбинантиых моле- кул ДНК. Пря дей- ствии одной рестрик- тазы на различные мо- лекулы ДНК обра- зуются фрагменты с комплементарными однодепочечнымя кан- нами. Соединение та- ких фрагментов в раз- ных сочетаниях может приводить к образова- нию рекомбинантных молекул ДНК.
Под лействием ДНК-лигазы формирование реком- бянаитаых молекул за- вершается установле- нием коваяентных свя- зей. Организания и передача генетического материала 9. Методы работы с ДНК Векторы для клонировании ДНК Методы клонирования чужеродной ДНК в клетках Е, сой удобно проиллюстрировать на примере плазмиды рВВ 322, специально сконструированной Франциско Болваром и Раймондом Родригесом для клонирования маленьких фрагментов ДНК, состоящих всего из несколъких тысяч пар оснований или еше меньше.
Эта плазмнда невелика (43б2 нуклеотидные пары), несет гены антибиотикоустойчивости атр и зе1 и в каждой бактериальной клетке может присутствовать во множестве копий. Последовательность нуклеотидов плазмиды известна. Ее физическая карта представлена на рис.
9.11. Обратите внимание на то, что имеется один сайт для рестрнктазы Ри) в гене атр и по одному сайту для рестриктаз ВащН1 и Яа)1 в гене сез. Наличие этих сайтов именно Тв 3 ~ рЯС101 дсо щ т- и — ! 436! ! 1 нл. Рис. 9Л1. Физическая карта кнонирующей плазмнды рВВ322. Этв плвзмидв сконструирована из трех частей. Участок начала реиликвнии (оп) — из нназыиды рМВ!; ген !е1-из ллвзмиды рВС!01, а сен ов!р-из трвнснозонв ТнЗ.
Указаны соответствующие уникальные святы рестрикции. рай322 т з рМВ! -/ -1.. - х,ряс!о! ож рмв!' жать ДНК этих клонов в больших количествах. Совокупность методов, объединяемых названиями «клонирование», или «генная инженерия», произвели революцию в генетике, биохимии и биотехнологии, В настоящее время ДНК эукарнотических организмов может изучаться на уровне последовательности нуклеотидов с той же детальностью, которая еще недавно была возможна лишь в отношении ДНК вирусов. Методы генной инженерии позволяют использовать Е сой в качестве фабрик для производства продуктов функционирования генов человека, например, для производства инсулина и гормона роста.
Вероятно, в недалеком будущем это даст возможность успешно и недорого лечить диабет, возникающий при недостатке инсулина в организме, и карликовость, являющуюся следствием недостатка гормона роста. Методы рекомбинантных ДНК открывают широкие перспективы в решении проблем медицины, сельского хозяйства и химической технологии. Эти методы обещают возникновение новой индустрии, называемой биотехнологией, привлекающей в настоящее время внимание средств массовой информации и финансирующих организаций.
Организация и передача генетического материала 278 -в Ваш н! Яа! ! Рн ! -в вши! в н! Ртт Ва~л Н! в н! в н! ллл клсюк дами. шлмл оому Перелеча- тывалле кололлй лолы несут ум ш!и в генах устойчивости к двум антибиотикам дает возможность отбирать плазмиды, несущие чужеродную ДНК !рис. 9.12).
Плазмнду рестрицируют ВатН1 и образовавшиеся линейные молекулы смешивают с фрагментами чужеродной ДНК, полученными также под действием этой рестриктазы. Одноцепочечные комплементарные концы этих молекул могут соединиться различными способами, прежде чем под действием лигазы возникнут ковалентные связи. Во-первых, концы линейной молекулы ДНК плазмиды могут соединиться друг с другом: при этом восстановится исходная кольцевая плазмида с интактным геном ге!. Возможно, однако !именно это и требуется), что перед превращением линейной молекулы ДНК плазмиды в кольцевую, между ее концами встроится фрагмент чужеродной ДНК, при этом целостность гена !ег нарушится. Полученной тп уйго смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е. со)й предварительно обработанные ио- Чашка с тетрадлклллом Рис.
9.12. Интеграция чужеродной ДНК в плазмнлу РВК322 и отбор клона-носителя ДНК. Вставка чужеролвой ДНК в сайт ВашН1 локализованный внутри гена тет, лвактввнруег этот ген. Клетки с реком- бннаитной платкьтвдой будут обладать фелотипом Тс! Атер, а клетки с ллаэмидой рВК322, восстановившей свою прежнюю структуру — фенотвпом Те! Аюр .
в 9. Методы работы с ДНК 279 Лиикер ДНК Литвзе рестриктезе + ППШШПШ) — э ИЙПППППШШИИ вЂ” — -ь ж!й)ПППППШаитт Рис. 9.13. Сиитетиче- ские фрагменты ДНК, содержащие сайры ре- стрикции, можно ис- пользовать в качестве связующих звеньев (лиикеров) цри создании рекомбилаитных моле- кул. А. Любой фраг- мент ДНК без липких концов можно клони- ровап при использова- иии лвухцецочечцых лиикеров.
Б. Структура трех линкоров. Квоиируемый вектор Литззз Нра П Ват ! Нра П НЫЦ!П А! ! Еаа К! ССС~!ВА ттССС С~(СР САТС~ССС ССА~АС(СТТСС 6 С С Т Т А А 6 С С С С С1 С Т А С1 С С~С С С Т Т С С А А С С нами Са' ' с тем, чтобы сделать эти клетки проницаемыми для ДНК. Затем трансформированные бактерии высевают на среду, содержащую ампипиллин. На таком агаре размножаются лишь те клетки, которые обладают фенотипом Ашрк и, следовательно, содержат восстановленную плазмиду илн плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК.
Колонии, выросшие на среде с ампициллином, перепечатывают на чашки с тетрацнклином. Клетки с восстановленной кольцевой плазмидой, содержащей неповрежденный ген !Вг, будут иметь фенотип Теук, тогда как клетки, в плазмиду которых встроен фрагмент чужеродной ДНК, окажутся чувствительными к тетрациклину (Те!В). Клоны с фенотипом Те!ВАшр" можно отобрать для дальнейшего исследования встроенных фрагментов ДНК. Процедуру клонирования можно вести с помощью рестриктазы бц11, а не ВитН1, и точно так же отбирать колонии трансформантов с фенотипом Те!ВАтпр"; прн этом будут клонироваться фрагменты чужеродной ДНК, специфичные именно для 5а11 и отличные от фрагментов, клоннруемых ВатН1.
Можно также в качестве рестрицируюшего фермента при клонировании с помощью вектора рВтт322 использовать РМ1; при этом для дальнейших исследований природы встроенных фрагментов следует отбирать колонии с фецотнпом Те!аАщрз. Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеотидов, получивших наименование «ликкерьр> (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие «тупо- конечные» (т.е.
не обладающие одноцепочечнымн концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9.13). Эти фрагменты могут «выстригать- 280 Организация и передача генетического материала Ега Н! .сипы Геном мыши .
—::;Эг — -~ л ДНК харон. фага й | Правое плечо Обработка Еса Н! Я и Ь Левое плечо и Частичное расщепление реагряктяэай Ега П! в результате которого абрвзуютея фрагменты плавай около 20 000 в. ц. Внугренвяе фрвгмевол Удчлевяе с помощью ьчекграфарещ вяутревнвх фрагментов, яаеушеагвеввых лля ревявкьцяя ДНК фага Я щщ Ь Упаковка в головка фягав Х и ппа Заражение Е сап рекамбнячятяммя фьгавымя чвепщчмя Паву тяпая харак фвгав Л, содержащих в еавакупваагв весь галам мыши ся» из любых молекул ДНК физическими методами; границы фрагментов при этом не зависят от распределения сайтов рестрикции.
Геном бактериофага )ь был превращен генными инженерами в наиболее удобный вектор для клонирования крупных фрагментов чужеродной ДНК. В геноме фага л. есть два участка, не содержащие генов, необходимых для дитического развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно, 22000 нуклеотидиых пар в середине карты и 3000 между генами Р и !Е (см. рнс. 7.7).
Таким образом, около Рнс. 9.14. Использование харон-фага х для !лавирования крупных фрагментов ДНК мыши, Эффективное клонирование оказы- вается возможным благодаря действующей и гйго системс упаковки, полученной из ин- фицированных фатом х клеток Е. сой. Эза система содержит все структурные белки и ферменты, необходимые зшя того, чтобы инфицирующие частицы фага были носителя- ми векторной ДНК, в том числе ферменты, разрезающие длинные контамерные моле- кулы ДНК. 9. Методы работы с ДНК 281 25000 пар нуклеотидов ДНК фага Х можно заменить чужеродной ДНК, не затрагивая способности этого фага выступать в роли вектора. Нормальный геном фага й содержит 49000 нуклеотидных пар, однако головка фага может вместить от 38000 до 53000 н.п., продолжая при этом функционировать нормально.
Можно сконструировать множество различных линий фага Х, предназначенных для клонирования разнообразных фрагментов чужеродной ДНК, подчиняющихся лишь сформулированным выше ограничениям. Примерами таких векторов могут служить так называемые харон-фаги Х (по имени мифического перевозчика в царство мертвых) и 1.81-фаги (осуществляющие общую трансдукцию). Они сконструированы таким образом, что гены, ответственные за жизненно важные функции, локализованы на левом и правом концах генома, а середина существенных генов не несет и кроме того ограничена двумя различными сайтами рестрикции.
Эта центральная часть генома содержит гены, влияющие на морфологию колоний, так что по их форме можно сразу определить, чужеродная илн собственная ДНК включена в головку. Использование харон-фагов Х при клонировании фрагментов чужеродной ДНК схематически изображено на рис. 9.14. Виблиотеки геномов Одна нз основных целей клонирования различных фрагментов ДНК прокариотических и эукариотнческих организмов состоит в расчленении геномов на участки, достаточно малые для того, чтобы было возможно их детальное исследование. Интуитивно представляется очевидным, что, если накопить достаточно большое количество клонируемых фрагментов ДНК, эта коллекция будет включать по меньшей мере по одному экземпляру каждой последовательности генома.
Такую коллекцию клоннруемых фрагментов называют библиотекой генома или банком генов. Если клонируют фрагменты генома Ргохор81|а те1аводазсег средней длины 15 — 20.10' н.п., то для того, чтобы в коллекции были представлены все участки генома, достаточно около 40000 независимых клонов (общая длина генома составляет около 1,5.10' н.п.). Для полной библиотеки генома человека требуется около 800000 клонов (см. дополнение 9.2).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
