Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 50
Текст из файла (страница 50)
8.2!. Бакте- риальные колонии Еа!топейа рагагурй! в пробирке с мягким вгврам. [ьенетбетд 3. (1956), Оепебсв, 41, 845.! опыте. Определите расположение мутаций Дс друг относительно друга и относительно гена тег. Реципиенты !!сА йен ДсС ниП [8Л1. Мутанты Йг и !еи у Е со!! -ауксотрофы, требующие для роста треонин и лейцин, соответственно. Мутация агаЗ обусловливает неспособность клеток использовать арабинозу в качестве источника углерода. В приводимой таблице указаны частоты котрансдукции этих генов фагом Р!.
Какая селективная среда использовалась в каждом случае и какова последовательность генов? '; 8.12. Мутации ага ! и ага! очень тесно сцеплены с агаЗ. Все онн делают клетки Е. сай неспособными к использованию арабинозы в качестве единственного источника углерода. Для того, чтобы установить взаимное расположение этих мутаций, проводили реципрокные трансдукционнь(е скрещивания, результаты которых представлены в таблице. Во всех случаях отбирали рекомбинанты Ага т и среди них определяли долю носителей неселективных маркеров !еи и Йг '.
Каково взаимное расположение этих маркеров? Доля колоний, содерРеципиент Донор жещих неселективный маркер (4) По Пюм У., Епе(тйет 0959) юга!аеу 9, 3(4 8.13. Когда в качестве реципиентных используются клетки агаЗ, а донорными клетками для фага Р1 служат ага), ага2 илн клетки дикого типа, н отбираются трансдуктанты Ага , то на селективной среде наряду с крупными колониями появляются крошечные колонии, неразличимые невооруженным глазом. Сформулируйте гипотезу об их происхождении. 8.14. Клетки некоторых штаммов Забпаиейа рагагурЬ! подвижны, поскольку обладают жгутиками; клетки других штаммов лишены жгутиков и неспособны к самостоя.тельному движению. Фаг, осушествляюший общую трансдукцню у За!топе!!а (Р22), вырапвтвают на подвижных клетках и инфицнруют им неподвижные клетки.
Когда инфицированные клетки неподвижного штамма высевают на поверхность столбика из мягкого агара, то после инкубации можно увидеть тянушнеся вглубь агара от поверхности цепочки мелких колоний [рис. 8.21). 259 8. Биктериолвгтый геном Доля нелиаогенных рекомбининтов Профит и и твг"ь 'ж. Са) Зтг Л 21 82 434 424 381 0,82 0,10 0,89 0,68 0,03 0,15 0,16 0,01 0,21 0,11 к 0,01 0,025 Отношение Селективные и неселективные маркеры в рекомбннантах: Скрешиеание тьг'ьеи" Згг гкг !еи "хтг (селективные) да! гтг (селективные) гг Частота неселективных маркеров Частота неселективных маркеров агг гоп !ас+ да(+ Л гяг !еи" ап гол !ас" (Л) 3,7 0,92 0,73 0,49 0,31 0,15 0,75 0,75 0,74 0,74 0,84 54 0,86 0,60 0,21 0,025 0,001 0,82 0,79 0,78 0,74 0,01 Н!гН(Л) х г (Л)' Н!гН(Л)' х Р-(Л)- В культурах, выделенных из этих колоний, все клетки оказываются неподвижными.
Объясните. 8.15. При некоторых скрещиваниях с участием лизогенных штаммов профагн типа Л могут использоваться в качестве бактериального генетического маркера. В таблице представлены результаты скрещивания между нелизогенным 1(!у) штаммом Н(гН,В!г и штаммами г 3 ТЬг Ьеп Оа1 8(г", лизогенными по одному из нескольких различных профагов, например, Г,ТЬг 1.еп Оа! Бпи (Л). Отбираются рекомбинанты ТЬг е 1.еп+ 8!г или Оа! е Кгги и среди них определяют долю (!у )Н1г.
О наличии маркера 1у судят по чувствительности к соответствующему фату, другими словами, утрата профага рекомбинантом интерпретируется как наличие неселективного маркера. На основании этих данных определите взаимное расположение профагов на физической карте Е сой и их положение относительно ТЬг'1.еп' и Оа)+. 8.16. При скрещивании штамма Н1г, лизогенного по фату Л, с нелизогенным г -штаммом может иметь место феномен, называемый зиголгической индукцией. Что это такое можно понять, сравнивая рекомбинанты, получаемъге в реципрокных скрещиваниях между содержащими профаги штаммами Н(гН8(гв н г,ТЬг 1.еп Аг Т1КЬас йа! 8!г~, результаты которых приведены в таблице.
Основываясь на представленных в таблице данных о частоте возникновения рекомбинантов при зиготической индукции,постройте гипотезу, объясняюшую этот феномен, и предложите постановку эксперимента для проверки вашей гипотезы. Методы работы с ДНК Наследственная информация кодируется последовательностью нуклеотидов в молекуле ДНК. Любая экспериментальная методика, предназначенная для определения последовательности нуклеотидов, требует химически чистых препаратов ДНК.
Слово «чистый» в данном случае означает не только отсутствие примесей других типов молекул, например РНК и белков, но н гомогенность нуклеотидных последовательностей. Все молекулы ДН К в таком образце должны быть одинаковы как по размерам, так и в отношении последовательности нуклеотидов.
По этой причине первыми для изучения генетической организации на уровне нуклеотидов были выбраны вирусы прокарнотических и эукариотических организмов. Геномы вирусов относительно малы, и вирусные частицы можно довольно легко отделить от клеточного материала еще до химического выделения иитактных молекул ДНК из вирусных частиц. Описанное в гл. 7 гетеродуплексное картироваиие фага Х основано на умении генетиков выделять интактные молекулы ДНК из различных линий фага Х, геномы которых с генетической точки зрения уже изучены.
То же самое относится и к исследованиям, показавшим концевую избыточность нуклеотидных последовательностей фагов Т2 и Т4 н циклические перестановки в их геиомах. Напротив, огромная длина молекул ДНК бактериальных хромосом и хромосом эукариот делает эти молекулы очень уязвимыми в отношении разрывов при их выделении из клеток. Разрывы происходят случайно вдоль двойной спирали, и в результате возникает сложная смесь более мелких молекул ДНК, отличающихся друг от друга длиной и последовательностью нуклеотидов. Извлечь из такой смеси химическими методами информацию об исходной конкретной последовательности нуклеотидов в интактной хромосоме невозможно.
9. Ментоды работам с ДНК 261 В 1970 году Смит и Вилкокс получили чистый препарат нового типа нуклеазы из бактерии Ниетор)т((иа ипЯиепгае. Это событие оказалось решающим для дальнейших исследований. Выделенная ими нуклеаза расщепляла молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовагнелвносгнях нуклеонтидов. Это открытие, а также создание методов клонирования относительно небольших фрагментов двухцепочечной ДНК привело к «рекомбинантной революции» в исследованиях ДНК и послужило основой современных генетических и биохимических исследований.
Метод рекомбинантных ДНК решил проблему получения препаратов ДНК, содержащих молекулы одинакового размера и с одинаковой последовательностью нуклеотидов. Прежде чем перейти к подробному рассмотрению этого метода, мы сначала познакомимся с информацией, которую можно получить при случайном расщеплении ДНК и, соответственно, при исследовании неоднородной смеси нуклеотидных последовательностей.
Хотя информация, полученная такими методами, носит статистический характер, тем не менее до 1970 г. она играла важную роль в описании общих закономерностей организации последовательностей ДНК многих организмов. Эта информация бьша получена из теоретических и экспериментальных исследований реассоциации одноцепочечных фрагментов ДНК.
Кинетика ренатурации ДНК Нукяеапия (реакпия орога порядк ' Застегивание" (реакння рното порядка) Нагревание Нативиая ДНК денатурированная ДНК Ренатурированная ДНК Рис. 9.1. Последовательные этапы денатурапии и ренатурапии фрагментов ДНК. Реиатурапия требует осуществления двух отдельных реакций: (1) нуклеации-образонания водородных связей между двумя олнопепочечными фрагментами; это бимолекуляр- иая реакция, т.е. реакция второго порядка;(2) эастегиваиия, при кото- рой водородные связи образуются между всеми основаниями компле- ментарных нитей; это мономопеку- лярпая реакция, т.е. реакция первого порядка. Если комплементарные цепи нативной двухцепочечной ДНК разделить посредством нагревания или в щелочной среде, то при правильно выбранной температуре и концентрациях солей в растворе, они довольно легко снова образуют двойную спираль, Мы уже встречались с несколькими примерами такой реассоциации при обсуждении образования гетеродуплекса ДНК в главах 7 и 8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
