Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 51
Текст из файла (страница 51)
В реакции ренатурации, как показано на рис. 9.1, можно выделить две отдельные стадии. Первая стадия-нуклеация — заключается в образовании водородных связей между несколькими, принадлежащими двум раз- Оргинизинил и передача генетического материала 2б2 ПО о я й ОД о 0 0,0~ 04 1 ~а Начачьная концегпрацня время, се с (логарифмическая шкала) 100 Рис.
92, Кинетнка идеальной реак- ции второго порядка прн й, =1. По ординате оыюжена доля олпопепо- чечных фрагментов н реакционной смеси по прошествии е секунд от на- чала реакции. По абсциссе отложена величина сей гле с„ †начальн концентрация олнопепочечной ДНК н молях нуклеотниоа на литр. ным цепям комплементарными основаниями; остальные взаимно комплементарные основания выстраиваются друг против друга. На данной стадии происходит образование связи между двумя разными одноцепочечными молекулами. Это реакция второго порядка, ее скорость пропорциональна квадрату концентрации ДНК. Вторая стадия — реакция «застегивания молнии», при которой устанавливаются водородные связи между выстроенными друг против друга комплементарными нуклеотидами. Эта стадия представляет собой мономолекулярную реакцию; скорость образования водородных связей пропорциональна концентрации ДН К, т.
е. кинетически является реакцией первого порядка. Какая из этих двух стадий идет медленнее н, следовательно, определяет общую скорость ренатурации ДНК, должен решать эксперимент. Показано, что лимитирующей является стадия образования первых связей между цепями. Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в процессе реакции ренатурацин описывается гиперболической функцией (вывод формулы приводится в дополнении 9.1), График зависимости концентрации от времени при кг = 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени (г„), необходимому для ренатурации половины исходного количества ДНК (с100 = 0,5), можно определять показатель реакции РенатУРации гс ги,).
Эта величина пРЯмо пРопоРЦиональна числУ нУ- хлеотидов в нвповторяюи1ейсл последовательности ДИК. Эта закономер. ность иллюстрируется на рис. 9.3 для нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов, Другими словами, мы можем определить общий объем уникальной генетической информации, кодируемой ДНК, измеряя значение с„г„! Более того, экспериментально определяя кривые ренатурации ДНК, мы можем установить присутствие в геноме повторяющейся генетической информации.
На рис. 9.4 сравниваются кинетика ренатурации ДНК прокариот и эукариот. Обратите внимание на то, что кривая ренатурациии ДНК Е. сой Число иуклеотидимх лар (сложность ДНК) Г) 1О РО 'т 1Оз ~ Раз 10з~ Рдь 1 (От 1Оь )оз1 1О ь 1,О 1,О 0,5 о (О НР 1О' (О' о 1О ь 1(гз 1О 4 РО з РО з (О-' сьт(мОль Рис. 9ло Взаимозависимость между зксцериментально определенными значениями с 1„, и сложностью (М) использованных в зкспернмеите фрагментов ДНК. При фиксирован- 1,0 0 1О з 1О ' 10 ' 1 Н(з (оз (оа сь (( моль сек(зз 1 Рис. 9кй Сравнение кинетики реассоциации фрагментон ДНК Е. сой и фрапнентов ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. сой очень близка к теоретической кривой, прел- ставленной на рис. 9.2, что указывает на то, что ренатурация ДНК происходит при един- ственном неизменном значении константы скорости реакции (с,.
Напротив, (рафик кнне- з и а к и о 0,5 о пп о ь и и о и 0,5 о о о сек(л) ном значении с„время, необходимое для ренатурации половины молекул, пропорционально )тз. (Вг(ггеп Е.У., Койпе В.Е. (!968). Зс)енсе, 161, 529.1 тики ДНК коровы по форме качественно от- личается от изображенного на рис. 9.2. ДНК теленка содержит последовательности рена- турируюц(ие как быстрее, так и медленнее последовательностей ДНК Е.
сой. (Вгйгеп И.У., Кайпе Р. Е. (1968). Яс(енсе, 161, 529.] Организация и передача генетическою материала Рнс. 9тк Нв рисунке в виде спектра изобра- жена частота последо- вательностей ДНК мы- ши с различной во- вторностью. Число ко- пий каждого типа по- следовательности оценнвввн во квнетиве Ренатурвцнв ДНК мы- ши. м в и. б 5 4 3 э ! 0 1ов, чвсла повторов почти тождественна теоретической кривой, представленной на рис.
9.2. Так как теоретическая кривая получена на основе предположения о том, что скорость реакции второго порядка )сз неизменна, это означает, что ренатурация фрагментированной ДНК Е. сой характеризуется определенным значением )с,. Что касается ДНК теленка, то, напротив, некоторые фрагменты ренатурируют со скоростью, много большей скорости ренатурации фрагментированной ДНК Е.
сей, тогда как остальная ДНК 1около 60;:) ренатурирует много медленнее. На основе этих наблюдений можно заключить, что геном эукариот (в данном случае геном теленка) содержит как нуклеотидные последовательности, представленные в геноме лишь в единственном экземпляре, так и различные нуклеотидные последовательности, каждая из которых многократно повторена в геноме. Так, например, основываясь на кривой ренатурации, можно показать, что геном мыши содержит сложный набор нуклеотидных последовательностей, частота представленности которых в геноме схематически изображена на рис.
9.5. Организация и возможные функции многократно повторяющихся нуклеотидных последовательностей в геноме эукариот были в 60-х годах, после нх открытия, предметом активного обсуждения. Около 10~„' генома мыши составляет совокупность тандемно расположенных последовательностей примерно из 1О нуклеотидов, повторенных 10в раз (рис. 9.5).
Этн последовательности ДНК локализованы преимущественно в окружающем центромеры гетерохроматине. Подавляющее большинство этих последовательностей, по-видимому, играют какую-то роль в структурной организации хромосом, поскольку они не транскрибируются в последовательности РНК. С другой стороны, большинство последовательностей с не столь высокой повторностью распределены по всему геному и транскрибируются в РНК. Природа этих последовательностей активно изучается методами рекомбинантных ДНК, о которых мы расскажем в этой главе. 9. Методы работы с ДНК 2б5 Дополнение 9.1 Кинетика ренатурации ДНК с ! (2) сс 1 + )02002 1 0,5 = 1 + )52002112 о~куда 1 с с 0 1!2 )02 (3) ааеэ 2О,5 й2 )!) (4) = )02 2(г.
2)С с' 1 — = )021 + СОЛ51. с 1 1 — =)г !+— С С0 !1-!2!5 Этапы последовательной денатурации и ренатурации ДНК схематически изображены на рис. 9.1. Ренатурация комплементарных одноцепочечных молекул в двухцепочечную происходит в два этапа: !) нуклеация (зацепление), 2) застегивание (наподобие застежки-молнии). Поскольку зацепление включает две одноцепочечные молекулы ДНК, скорость реакции пропорциональна квадрату концентрации ДНК (измеряемому по молярности нуклеотидов) и, следовательно, представляет собой реакцию второго порядка.
Напротив, в застегивании принимает участие уже единая двухцепочечная молекула, и потому это реакция первого порядка, а с точки зрения механизма — мономолекулярная. Экспериментально ренатурация ДНК идет в соответствии с кинетикой реакции второго порядка. Следовательно, лимитирующей стадией является установление первых связей между одноцепочечными молекулами (зацепленне). Пусть с — концентрация одноцепочечных молекул ДНК в момент времени г, а с0 — концентрация в начальный момент 2=0. Тогда уравнение реакции второго порядка, описывающее убывание концентрации одноцепочечной ДНК, имеет вид 2(С (1) Йг где )22 — постоянная скорости реакции вто- рого порядка, или Интегрирование этого уравнения дает При 2=0 с= с0, следовательно, сопхг = 1 = †.
Подставляя, получаем СО Время, за которое концентрация убывает вдвое (время полуренатурации), обозначается гп . Из предыдущего уравнения На рис. 9,2 представлен график зависимости с!!00 от ссг, он называется ссг-графиком. Ветмур и Дэвидсон показали, что константа скорости реакции второго порядка ренатурации ДНК !!2 обратно пропорциональна !11-числу нуклеотидов в неповторяюшихся участках нуклеотилной последовательности гаплоидного генома прокариот. Это соотношение задается форму- лой где 1.
†средн число нуклеотидов в одноцепочечном фрагменте, (3 †средн плотность точек, в которых устанавливается связь между двумя цепями, и — коэффициент. Комбинируя уравнения (3) и (4), мы видим, что величина ссгпх прямо пропорциональна !9. (а — коэффициент пропорциональности): со 21ы — — а!52. (5) Важность уравнения (5) демонстрируется рисунком 9.3, на котором представлены кривые ренатурации фрагментов ДНК, полученных из молекул ДНК различной сложности. Для молекул ДНК, для которых известив! значения Ь и )9, коэффициент пропорциональности а можно определить по 26б Организация и передача генетического материала Рестрикция ДНК и ферменты модификации Практически все виды бактерий синтезируют по одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечиой ДНК.
Эти эндонуклеазы назгаваются рестрицируюигими ферментами (или рестриктазами), поскольку их основная функция состоит, по-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайгон ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции.
Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствуюгцей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазамн. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее агакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки.
Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. набору значений сег„м получаемых при различных условиях эксперимента (при разных температурах и ионных силах раствора). В этом состоит один из наиболее важных результатов исследования кинетики, а именно: используя один и тот же набор условий эксперимента, можно по значению а рассчитать М для ДНК неизвестной природы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
