Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 45
Текст из файла (страница 45)
много чаще, чем этого можно было бы ожидать, основываясь на предположении об обратных мутациях. Эти эксперименты обнаружили существование у Е. са!( двух половых типов, обозначенных символами Г ' и Г . Затем было установлено, что клетки типа Г ' содержат Г-фактор, или эписому, тогда как в клетках Г -типа эта эписома отсутствует.
Дальнейшие исследования бактерий лвух типов привели к поразительному и совершенно неожиданному открытию: оказалось, что Г- фактор инфекционен. Когда обладавшие Г-фактором и чувствительные к стрептомицнну клетки (8(г, Г ) смешивали со стрептомицинустойчивыми бактериями (8(гк, Г ), и эту смесь высевали на агар, содержащий стрептомицин, то колонии образовывали, естественно, лишь ягк-клетки, т.е. клетки, несущие аллель а(гя.
Большинство из этих колоний оказалось Г -, а не Г -типа. Г-фактор содержит множество генов, сообщающих ему инфекционность. Некоторые из этих генов кодируют белки пилой, структур тина трубочек, расположенных на поверхности Г+ -клеток (рис, 8,3). Г-пнли соединяются с соответствующими рецепторами на поверхности Г -клеток, что приводит к образованию цитоплазматического мостика между двумя клетками. В процессе роста Г"- клеток Г-фактор реплицируется по тета-типу, так же как и бактериальная хромосома. Однако, когла между Г ' - и Г -клетками возникает цитоплазматический мостик, Г-фактор переходит к реплика- Организация и передача генетического лштериала Боктороольнок ьромооомо р Ряс, 8.4. Схематическое изображение механизма, с помощью которого ДНК Г-фактора передается от Г"-клетки Г -клетке в процессе рспликаиии ио типу катяшеьося кольца.
ции по сигма-типу (см. гл. 4). 5'-РО4 одноцепочечный конец реплицирующегося Г-фактора проникает в Г -клетку, и там синтезируется комплементарная цепь. Репликация ДНК Г-фактора приводит к переносу копии Г-фактора в Г -клетки, превращая их в Г'-клетки (рис. 8.4). Как уже упоминалось ранее, Г-фактор представляет собой эписому, которая может либо существовать самостоятельно, либо встраиваться в репликон бактерии. В встроенном состоянии Г-фактор может переносить бактериальную хромосому в Г -клетки. Частота возникновения рекомбинантов дикого типа для генов бактериальной хромосомы при скрещивании Г "- и Г -штаммов очень низка (порядка одной клетки на ! Оз родительских клеток), поскольку лишь небольшое число клеток Г'- кулътуры участвует в образовании рекомбинантов, хотя частота инфицирования Г-фактором довольно высока.
Однако, из Г -культуры можно выделить штаммы, при скрещивании которых с Г -клетками рекомбинанты образуются гораздо чаще (частота рекомбинации > 10 з). Эти штаммы обозначаются символом Н(г (от англ. /нд)ь уге4иенсу гесотЬ|наг1он — высокая частота рекомбинации). В них Г-фактор в свободном, автономном состоянии отсутствует. он встроен в бактериальную хромосому. Когда клетки Н(г вступают в контакт с клетками Г между ними образуется цигоплазматический мостик, называемый коньюгационной трубкой, и интегрированный Г-фактор инициирует реплнкацию бактериальной хромосомы по типу катящегося кольца с того сайта, в который он встроен.
Эта репликация приводит к переносу бактериальной хромосомы в Г -клетку (рис. 8.5). Когда копия бактериальной хромосомы клетки Н(г попадает в клетку Г, становится возможной рекомбннация между генетическими маркерами, содержащимися в хромосоме клетки Н(г, н генами, содержащимися в хромосоме Г -клетки (рис. 8.5).
При конъюгации клеток Н(г и Г часто происходит разрушение соединяющей их конъюгационной трубки и, соответственно, обрыв хромосомы Н(г. В результате в Г клетку целая Н(г-хромосома попадает довольно редко. После того, как конъюгация инициирована, возникновение рекомбинантов дикого типа определяется исключительно жизнеспособностью Г -родителя. К такому выводу можно прийти при анализе результатов реципрокных скрещиваний, выполняемых иа минимальной среде, содержащей стрептомицин. 8.
Бакглерианьньш геном 235 р'-клетка Нгг-клетка Включение р фектора Г -клетке Нй.клетке Б Нечюю кольюгеции р -клетке НГг.клетке Скрешивание 1: Н1г, ТГзг' Ьец' Яггз х Р, ТГГг 1.еп Яга Результат: колонии образуют лишь рекомбинанты ТГзг' Ьец ' Яги. Скрещивание рл НГг, ТГГГ Ьеп Ягги х Р, ТГгг Ьецг 81гч, Результат: колоний нет. Первое скрещивание показывает, что применение стрептомицина устраняет колонии, которые в противном случае образовались бы из клеток родителя НГг. Формировать колонии могут только рекомбинанты дикого типа, поскольку родители Р -типа не могут расти на минимальной среде в отсутствие треонина и лейцина. Второе скрещивании показывает, что для образования рекомбинантов необходима жиз- Рис.
8.5. Мобилизация бактериальной хромо- сомы при включении Е-фактора в клетке НГг. При коиъюгации ре- пликация хромосомы иачииается с всзроен- ного Е-фактора. Отре- зок р-фактора входит 5скоицом в Е -клетку и увлекает за собой ДНК НГг-клетки. Если коиъюгацию прервать ло того, как в клетку перейдет вся Нйьхро- мосома, то клетка-ре- цилиеит сохоавит Е -тип. В Перенос олноненочечной ДНК ло мехеиизму *'кетяьзегоея кольца" 236 неспособность родителя Г, а не Н1г. Рекомбннантные колонии оггк не образуются, поскольку ген хггк локализован слишком далеко от сайта, с которого начинается передача хромосомы и потому почти никогда не попадает в Г -клетку.
То, что поступление бактериальных генов нз Н1г в Г -клетку происходит последовательно, всегда начиная с сайта интеграции Г-фактора в бактериальную хромосому, дает возможность картировать гены по порядку нх попадания в Г -клетку гподробнее мы обсудим это в следующем разделе). Как показано на рис. 8.5, проникновение хроьлосомы в Г -клетку всегда начинается с нуклеотидиой последовательности интегрированного Г-фактора Прн этом в Г -клетку поступает не весь Г- фактор. Для того чтобы в клетку попала оставгпаяся его часть, необходимо, чтобы в Г перешла вся НГг-хромосома.
Это случается очень редко из-за спонтанных разрывов коньюгационной трубки, и поэтому большинство отбираемых рекомбннантов остаются принадлежащими Г -типу. Физическое картирование бактериальных генов методом прерванной конъюгации Последовательное поступление генов из Н1г в Г -клетки представляет возможность картировать их в бактериальной хромосоме в соответствии с порядком и временем их попадания в клетки. Рассмотрим, например, следующее скрешнвание. Скрешивание 3: Н1г, ТЪг ь Ьеп+ Агх Т15 1 ас Оа1 ', Ягз х Г, Тугг Ьец Аг" Т1" 1.ас 63а1 оггк 0 1О 20 30 40 50 60 Продолжигельносп коньюгации (мии) Рис.
З.б. Графики зависимости доли неселективных маркеров срели отобранных рекозкибинантов типа ТйгьЬен Ягг в скрещивании 3 от продолжительности конъюгации. После прерывания конъюгации культуру высевают на селективную среду. Эк- страполяция графиков лля частоты каждого из иеселективных маркеров к оси абсцисс дает время от начала коныогации, по прошествии которого маркер становится способен к рекомбинации с хромосомой Р -клетки. 100 и ," ко И'ю 60 и й и 40 е е гя ь $20 о и Организация и передача генетического материала 8.
Бактериалыеый генон Рпс. 8Л. Схема, иллю- стрирующая поляр- ность переноса Нй- хромосомы в экспери- менте с прерванной конъюгацней. К ре- комбинации с хромосо- мой Р -клетки спо- собны лишь те гоны Н(г-хромосомы, ко- торые х меме~ту пре- кращения конъюгацнн оказались в репипнент- ной Г -клетке еяьюгецяя рервеяе через 5 ияп 10 ияя 15 мяя 20 мян Скрещивание между указанными штаммами начинается со смешивания двух культур в момент времени г = О. Через последовательные интервалы времени из смеси отбираю~ пробы и резко взбалтывают их на мешалке с тем, чтобы разрушить конъюгационные трубки, соединяющие скрещивающиеся клетки.
Затем образец высевают на агар со стрептомицином, содержащий в качестве источника углерода глюкозу. На этой среде отбираются рекомбинанты Т)зг' х.ец+ Ягк, Соответствующие три маркера 16г', !еи' и х1гя, назглваюься селектиеными. Гены, обусловливающие чувствительность к азиду (ан), к фату т1 (гоп), гены утилизации лактозы ((ас) н галактозы (аа() являются в данном случае иеселектияпыми маркерами, поскольку среда, на которой выращиваются клетки, не позволяет различать вллели этих покусов у участвующих в скрещиваниях бактерий. Затем отобранные рекомбинанты Т)зг ' ).еп ' Бгг перссевают на различные среды, с тем чтобы определить генотипы этих рекомбинантов по неселектнвным маркерам.
Частота соответствующих аллелей откладывается на графике как функция от про- 238 должительности скрещивания (рис. 8.6). Полученные кривые показывают, что различные неселективные маркеры Н(г становятся способны к рекомбинации с хромосомой Г -клеток по истечении различного времени от начала скрещивания (рис. 8.7). Экстраполяция частоты каждого маркера к нулю указывает время попадания маркера в г клетку (рнс.
8.6). Эти данные позволяют упорядочить гены по Н(г хромосоме, начиная от точки интеграции г-фактора, и оценить физические расстояния между ними, измеряя эти расстояния в минутах, прошедших с начала скрещивания. Кольцевая форма генома Е. сод Из одного Г штамма может возникнуть множество различных штаммов Н(г, для кажлого из которых характерна собственная локализация и ориентация Е-фактора в хромосоме бактерии (рис. 8.8). Это проявляется в описанных выше опытах с прерванной конъюгацией: в каждом Н(г-штамме передача бактериальной хромосомы начинается с собственной, иной чем у других штаммов точки; различна также и ориентация хромосомы при этом.
Для каждого штамма можно установить характер сцепления между генами, расположенными неподалеку от точки, с которой начинается передача бактериальной хромосомы. Совокупность таких данных по множеству различных штаммов Н(г позволяет установить характер сцепления маркеров в хромосоме в целом и построить физическую карту хромосомы Е сой. Как показано на рис. 8.9, эта карта имеет форму кольца, что полностью соответствует кольцевой форме бактериальной ДНК. ~~г Р А Рсо Вгс 8 1 асг Н Ваг сус А ху1 — сир С -си рва та1 А— 1ср 1уг Яй 1ш 504 Рис.
8.8. Сайты инте- грации Р-фактора в хромосому неко- торых Нгг-штаммов Е. сод Вставки обозна- чены стрелками, напра- вление которых со- ответствует направле- нию передачи хромо- сомы при конъюгацни. Стрелки внутри хромо- сомы указывают о.сно- шения сцепления, установленные для не- которых упг-штампов. Наложение этих стре- лок свидетельствует о кольцевой форме ге- нетической карты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
