Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Температурочувствительные мутации широко используются и в генетике бактерий. Необходимые для нормального существования (существенные) гены, которые невозможно выявить посредством ауксотрофных мутаций, обычно могут быть идентифицированы с помощью температурочувствительных мутаций. Примерами жизненноважных функций могут служить функции, связанные с синтезом белков или нуклеиновых кислот из молекул-предшественников — аминокислот нлн нуклеотидов (подробное обсуждение мутаций, затра1 ива ющих синтез ДНК, содержится в главе 13). Существуют также мутации бактерий, вызывающие устойчивость к определенным бактериофагам или антибиотикам. Первые из них обычно влияют на способность фага прикрепляться к бактерии-мутанту, поскольку у мутанта несколько изменены белки мембраны.
Устойчивые (резистентные) мутанты легко отбираются при посеве клеток, подвергнутых действию какого-либо мутагена, непосредственно на среду, содержащую данный фаг или антибиотик: выросшая бактериальная колония и есть мутант. Мутации, вызывающие устойчивость к определенным антибиотикам, хорошо известны, поскольку они создают серьезную проблему для медицины и здравоохранения.
Фенотип устойчивости к фагу Т1, обозначается символом Т1" (фенотип чувствительности к фагу — Т1 ). Соответственно, устойчивость и чувствительность к антибиотику стрсптомицину обозначают как 31га и 31гз. Ген чувствительности к фагу Т1 обозначается как гоп, (гоп ' — синоним Т1; ген чувствительности к стрептомицину — Мг (згг" -синоним лег"). Мутантные шгаммы легко получить при действии на бактерии ликого типа мутагенных факторов, например, рентгеновских или ультрафиолетовых лучей, илн химических мутагенов. Обработанную культуру высевают на пермиссивную среду. Например, если нужно получить ауксотроф по определенной аминокислоте, то сперва подвергнутые действию мутагена бактерии высевают на среду, содержащую все 20 аминокислот. После появления колоний, их перепечатывают на чашку с минимальной средой, для того чтобы определить, какие из зтих колоний ауксотрофные (рис.
8.1). Затем каждая из ауксотрофиых колоний с пер- 230 Болванка Стсрялвяая бархотка Бф!' ~ЧУ)Ьс ) Прижимают к нааерхнпсти чашки Петри с выросшими колсяяямп 4)й! .лг ' чм ю.' '„. 4)',;* Исчезлуашаа *;;ъ .аа . ", колония муталт Чашка-реплика (мяллммьлая среда) Исхсдная чашка (лоаяая среда) миссивной среды иперепечатывается» на 20 чашек Петри с минимальным агаром, к которому добавлено по одной аминокислоте. При этом выясняется, присутствие какой именно аминокислоты необходимо для роста мутанта. Для отбора температурочувствительных мутантов обработанные мутагеном клетки высевают на чашку и инкубируют при 30 С. Выросшие колонии перепечатывают и чашку-реплику инкубируют при 42'С.
Колонии, растущие при пермиссивной температуре 30 С, но не способные к росту при 42'С, образованы м-мутантами. Подвергая полученные мутанты повторному (и последующему) воздействию мутагена и производя соответствующий отбор, можно получать штаммы, содержащие по нескольку мутаций. Генетические элементы Е. ай Клетки Е. сай могут содержать по нескольку различных генетических элементов, каждый из которых способен к саморспликации. Хромосома бактерии — это длинная кольцевая молекула ДНК с мол. массой примерно в 2,5 10з дальтон, что соответствует 3,2 х 1Оа н.п. Как уже обсужда- Рис.
8.1. Метод перепе- чатывания колоний, при котором бактерии быстро переносят с одной питательной среды на другую. На рисунке схематически изображена последова- тельность операций, позволяющая иденти- фицировать ауксо- зрофныс мутанты, спо- собные к росту на ис- ходной обогащенной среде, ио не образую- щие колоний на новой (минимальной) среде.
18)еттг 6. 5., Са)епт)аг Я., 11978) Мо1. Станет)са, 2цд ей, )Хт. Н, Ргеещап, Бац Ргапс)асс.1 Организация и передача генетического материала 8. Бакгнериальный геном лось в. гл, 4, на бактериальной хромосоме имеется точка 1сайт), с которой начинаемся репликация ДНК, и от которой она распространяется в обе стороны при репликации тета-типа. Генетические факторы, управляюшие репликацией бактериальной хромосомы, локализованы в самой хромосоме. Хромосома вместе с сайтом инициации представляют собой самореплицируюшуюся генетическую молекулу — ренликон по терминологии, которую предложили Франсуа Жакоб, Сидни Бреннер и Франсуа Кузин.
В клетках Е. сой мокн ут содержаться и другие репликоны, способные сушсствовать отдельно от бактериачьной хромосомы. Они называются элисо.нами, и нлазмидами, и представляют собой кольцевые молекулы ДНК различных размеров от 1Оз н.п. до почти трети величины самой бактериальной хромосомы. Одна из наиболее интересных и тшательно изученных аписом получила наименование Р-фактора 1фактора фертильности). Р-фактор определяет половой процесс у Е.
со11. Эписома — это генетический элемент, который может сушествовать либо в форме репликона отдельно от бактериальной хромосомы, либо встраиваться в бактериальную хромосому и составлять при этом часть репликона бактерии. Эписомой является и бактериофаг )„способный существовать как вне клетки в форме фага, так и внутри бактериатьных клеток, либо в качестве отдельного репликона 1при литической инфекции), либо в форме профага, составляя часть бактериального рспликона. В противоположность эписомам, плазмиды не встраиваются в другие ре1шиконы, а всегда сушествуют в форме свободных (автономных) репликонов.
Умеренный фаг Р1, находясь в состоянии профага, представляет собой плазмиду, сушествуюшую отдельно от бактериального реплнкона. Однако, большинство плазмид не покидают пределов клетки и не образуют внеклеточных форм. Некоторые эписомы инфекционны, поскольку их копии могут переходить из одной бактериальной клетки в другую, в которой исходно аписом данного типа не было. Генетические функции, необходимые для репликации„ инфекционности и способности вытеснять другие эписомы, кодируются эписомальной ДНК. Во многих эписомах содержатся также гены, не необходимыс для их сушествования. Например, некоторые инфекционные эписомы содержат гены устойчивости к определенным антибиотикам. Бактерии, в которые попадает такой фактор устойчиеоопи, становятся устойчивыми к данному антибиотику.
Имея высокую селективную ценность в современных условиях насыщения антибиотиками, факторы устойчивости быстро распространяются среди различных штаммов и видов бактерий, в том числе патогенных. Это создает серьезные проблемы для медицины. Особенно опасна способность факторов устойчивости накапливать гены, обусловливающие устойчивость к разным антибиотикам, и передавать ранее чувствительным бактериям множественную устойчивость.
Г-фактор: генетический элемент, определяющий пол бактерий Р-фактор обладает поразительной способностью определять пол, казалось бы, бесполых бактерий. Вго существование было обнаружено генетиками, когда они пытались определить, происходят ли скрешивания Организация и передача генетического материала Рис. 8.2.
Использование множественно ауксотрофных штаммов дяя демонстрации скрещивания у Е, со)1. В этом скрещивании тег", Ь)о', гйг' и !еи ' -сепективные маркеры, а гол и 1ас — неселектнвные маркеры. 1йагтотт Л р. )1976). Мо!есп1аг Вш)оку ог бзе Степе, Згд ед., %. Ас Всп)аш!и, Мсп!о Раг1с, Са!тЦ '!Имеется перевод: Уотсон 2)нс. 1978. Молекулярная биология гена. М, Мир.] Минимельнея среда !глюкозе + неоргени— ческие сопи) Очень небольшое число клеток Мет' Вю' твг' бее'. Они возникают в результате генетической рекомбинедии, не что укезывеет поведение маркеров )лс и гол!ген, ответственный зз чувствительность к фету Т1) .
Кроме родительских генотипов )лс топанье юла в культуре сбнеружнвеются колонии с генотилеми )ес юл н 1ес' тот~э между различными линиями Е. со!8 Для этого исследовали возможность генетической рекомбинации между различными мутантными штаммами. Множественные ауксотрофы бактерий, полученные посредством нескольких последовательных этапов мутагенеза и селекции, смешивали и смесь высевали на минимальную среду. Появление колоний должно бьшо свидетельствовать о возникновении рекомбинантов дикого типа, как это изображено на рис. 8.2.
Использование множественных ауксотрофов гарантирует, что колонии дикого типа, способные к росту на минимальной среде, возникают именно в результате рекомбинации, а не вследствие обратных мутаций. Если штамм, ауксотрофный по одной аминокислоте, ревертирует к дикому типу с частотой ! 10е, то появление колоний дикого типа на минимальной среде можно расценить и как результат реверсии, и как результат рекомбинации. Если же мутант ауксотрофен по двум аминокислотам, то часто~а реверсии к дикому типу должна составлять 10' 10' = = ! 0' т. Однако, при использовании таких двойных ауксотрофов в эксперименте колонии дикого типа на минимальной среде образовы- 8. Бактераальный геном Рнс.
3,3. Электронная микрофотогра- фия клеток Г+ Е. сай (справа) и Г (слева). Е-пили можно отличить от пплей другого типа, поскольку к ним прикреплены частицы фага, специ- фичного в отношевии Р '-штамыов. Известно несколько таких бактерио- фагов, наслелственныы веществом у них всея служит РНК. РНК фага вводится в клетку через пили (Рго(. Сйаг)ез С. Вгтщп, )г. )айця Сагпапап, 1)пйегзлу о( Р)цзьшх). вались с частотой примерно ! .10з, т.с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
