Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Сушку завершают в вакуумном эксикаторе с парафнновой стружкой. После высушивания сосуд с сухим липидным экстрактом взвешивают. Степень извлечения липидов на стадиях экстракцин и очистки можно определить в контрольном эксперименте с использованием известных количеств очищенных суммарных липидов. 17.3.3.
Классы липидов Липиды могут связываться с твердым адсорбентом в хроматографической колонке. В качестве адсорбента чаще всего используют кремневую кислоту, окись алюминия и окись магния (равд. 16.3.2). Липиды связываются с помощью полярных, ионных и вандерваальсовых сил. Разделение осуществляют с использованием раство- зы ЧАСТЬ 1У.МЕТАБОЛИЗМ рнтелей увеличивающейся полярности, которые позволяют разделять лнпнды на классы, определяемые колнчеством н характером полярных групп в нх молекулах 119, 201. Описанный здесь метод основан на использовании обработанного кислотой флорнснла.
В качестве растворнтелей для элюнровання адсорбнрованных лнпндов применяют хлороформ, смесь хлороформа н ацетона н метанол. Их выбор определяется простотой н воспронзводнмостью методики, а также тем, что все фосфолнпнды элюнруются в одной фракции. Реактивы и л!атериалы Флорисил, обработанный кислотой; смешивают 100 г флорисила (60 — 100 меш, Г1ЗЛсг Бс!еппбс Со.) с 350 мл концентрированной НС! в колбе Эрлеимейера объемом 1 л и нагревают в течение 3 ч на кипящей водяной бане под тягой.
(Предостережение! Следует избегать вдыхания паров НС1. Работая с сильными кислотамн, необходимо соблюдать все меры предосторожности и не допускать попадания жидкости илн паров иа кожу илн в глаза.) Надосадочную жидкость осторожно декантируют и промывают отстоявшийся сорбент 50 мл концентрированной НС1. Добавляют еще 350 мл концентрированной НС! и нагревают суспензию в течение 12 — 15 ч (или в течение ночи) в круглодонной колбе с обратным холодильником прн 100'С. Все операции выполняют очень осторожно в вытяжном шкафу, избегая вдыхания паров.
НС! сливают и выбрасывают, находящийся в осадке адоорбент трижды промывают дистиллированной водой путем декантацни, а затем — в воронке Бюхнера до нейтрализации промывных вод. Остаток высушивают вначале отсасыванием на воронке, а затем нагреванием флориснла при 120 С в стеклянной чашке в течение ночи, Еще раз обрабатывают кислотой и промывают водой. Воду из адсорбента удаляют, отсасывая на воронке. Последовательно добавляют !50 мл метанола, 150 мл смеси метанол †хлорофо (1: 1, по объему), 150 мл хлороформа и 150 мл зфнра.
Адсорбент высушивают в течение ночи прн 120'С в стеклянной чашке. (Предосгереягенпе! Эфир может взрываться прн контакте с шименем или раскаленнымн электрическими проводами. Его удаляют из адсорбента как можно полнее, и сушку проводят в вытяжном шкафу,) Свежеперегнанный хлороформ. (Предостережение! См. равд. 17.3.!.) Ацетон и метанол. (Предостережение! См.
!7.3.!.) Стеклянная хроматографическая колонка размером 1Х30 см, снабженная емкостью для растворителя (делнтельной воронкой с тефлоновым краном), укрепляемой и верхней части колонки с помощью стеклянного шлифа 24749, очищенного от смазки. В нижней части колонки должен находиться фильтр из пористого стекла или тампон нз стекловаты, а также тефлоновый кран. 312 гх химический сОстАВ Методика 12 г обработанного кислотой флорисила суспендируют в дважды перегнанном хлороформе.
Суспензию помещают в колбу или в эксикатор и дегазируют под вакуумом в течение 10 мин. Дегазированную суспензикт переносят в хроматографическую колонку и дают возможность хлороформу вытекать из колонки до тех пор, пока его уровень не будет приблизительно на 1 мм превышать уровень адсорбента. 150 — 200 мг очищенных суммарных липидов (см. предыдущую методику) растворяют в 3 мл хлороформа. Раствор наносят на колонку и дают ему впитаться так, чтобы сверху почти не было жидкости. Добавляют еще 5 мл хлороформа и ждут, пока он весь войдет в колонку.
Осторожно с помогцью делительной воронки наносят на колонку 50 мл хлороформа, не разрушая поверхностного слоя адсорбента. Дают растворителю пройти через колонку, собирая элюат в коллекторный сосуд со скоростью, не превышающей 1 мл~мин. Когда хлороформ войдет в слой адсорбента, делительную воронку заполняют 60 мл смеси хлороформа и ацетона. Элюат собирают во второй коллекторный сосуд со скоростью, не превышающей 1 мл/мин. Когда эта смесь раствори- гелей войдет в слой адсорбента, в воронку вносят 60мл ацетона и собирают элюат в тот же сосуд.
Затем наливают в воронку 60 мл метанола и собирают элюат в третий сосуд. В первом коллекторном сосуде содержатся нейтральные лнпиды (углеводороды, каротиноиды, хлорофилл, стерины и эфиры стеринов, глицериды, воска, спирты с длинными цепями и альдегиды) и жирные кислоты; во втором — гликолипиды, сульфолипиды, а иногда и некоторыс фосфатиды, в третьем — фосфолипиды. Последние можно обнаружить и количественно определить с помощью реакции на органический фосфат (равд. 17.3.5). 17.3.4. Фракционирование фосфолипидов Фракционирование фосфолнпидов проводят с помощью тонкослойной хроматографии, используя множество различных систем растворителей и камер [19, 20, 31].
313 ЧАСТЬ 1Ч. МЕТАБОЛИЗМ Реактивог и лгатериальг Стеклянные пластинки размером 20х20 см, с толщиной слоя оилнкагеля 250 мкм. Можно приобрести готовые пластинки с силикагелем нли приготовить самим, нанося силикагель на стеклянные пластинки [201. Пластинки ставят з камеру с дважды перегнанным анетоном и пропускают последний до их верхнего края.
Затем их высушивают иа воздухе в вытяжном шкафу и нагревают при 11О'С 30 мнн, охлаждают в зксикаторе и используют в день приготовления. Стеклянные камеры, или сэндаич-камеры, для тонкослойной хроматографии можно приобрести у различных фирм. В камеры, предназначенные для большого числа пластинок за 2 ч до фракинонироаания наливают сяежеприготоаленный растзоритель. Камеры зыстилаюг фнльтрозальной бумагой, пропитанной растворителем, и герметично закрывают для создания рааноаесня. Растаоригели.
(Предостережение( См. разд. 17.3.1.) Растзоритель 1: смесь хлороформа, метанола и воды (55: 25; 4; по объему), приготоаленная из перегнанных растворителей. Растзорнтель П: смесь хлороформа, метанола и 7 и. гндрокснда аммония (60: 35: 5; по объему). Азот: жидкий з сосуде Дюара. Микропнпегки: на 50 мкл, градуированные с интервалом 5— 10 мкл. Методика Высушенную фосфолипидную фракцию, полученную после разделения на колонке с флорисилом, растворяют в смеси хлороформа и метанола (1:1, по объему) до концентрации приблизительно 100 мг/мл).
Объем раствора регистрируют. Измеренное количество каждого раствора наносят на хроматографическую пластинку в виде пятна диаметром 1О мм на расстоянии 2,5 см от нижнего и столько же от правого края. Пробу наносят с помощью градуированной пипетки на 50 мкл разового пользования. После каждого нанесения пятно сушат в токе азота. На одну пластинку наносят до 0,1 мл раствора. После нысушивания в токе азота пластинку помещают н камеру с растворителем 1. Камеру герметично закрывают и пропускают растворитель до тех пор, пока его фронт не достигнет верхнего края пластинки (обычно 1 — 2 ч). Пластинку вынимают и высушивают иа воздухе, поворачивают на 90' по часовой стрелке по отношению к направлению первого растворителя и переносят в другую камеру с растворителем П. Этот раство- 3!4 1х химнчнскии сОстАВ ритель пропускают во втором направлении и затем высушивают пластинку на воздухе.
Хроматограмму окрашивают парами йода, как описано ниже, для обнаружения пятен фосфолипидов. Ее слегка увлажняют над водяным паром и снимают силикагель в каждом пятне лезвием бритвы. Снятый силикагель переносят в отдельную пастеровскую пипетку с тампоном из стекловолокна в суженном ее конце. По пипетке слегка постукивают до тех пор, пока силикагель не осядет в виде слоя на тампоне из стекловаты. Такую колонку из силикагеля промывают 2 мл смеси хлороформ †метан (1:1, по объему), а затем 2 мл метанола для элюирования фосфолипидов.
Эл1оаты собирают в пробирки со стеклянными пробками. Каждый фосфолнпид разливают поровну в две 15-мл пробирки со стеклянными пробками и в ампулу для лиофилизации и вдальнейшем анализируют. Растворители выпаривают при 37'С в токе азота. Одна пробирка предназначена для анализа на суммарный органический фосфор с целью определения количества каждого присутствующего фосфолипида. Две другие пробы можно подвергнуть кислотному или щелочному гидролизу с последующей идентификацией веществ для установления их возможной структуры. Окраска иодом для обнаружения линидов на хроматограммах [19, 201 В хроматографическую камеру помещают кристаллы иода, закрывают ее и нагревают на водяной бане при 60'С для выпаривания иода.
(Предостережение! Пары иода раздражают кожу. Они очень ядовиты и могут вызывать ожоги. Необходимо избегать попадания кристаллов иода на кожу и вдыхания паров. Все операции должны проводиться под тягой.) Хроматограммы помещают в камеру со стеклянными подставками, удерживающими их на расстоянии 2,5 см от дна камеры. Камеру закрывают на 1 мин, затем вынимают хроматограммы и рассматривают при дневном свете и под ультрафиолетовой лампой (365 нм). (Предостережние! УФ-свет может вызывать сильные ожоги глаз.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
