Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 16

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 16)

Легче всего этого достигают, если используют реципиент, лизогенный по трансдуцирующему фагу, так как лизогенные клетки иммунны к суперинфицированию гомологичным фагом. Можно также использовать такое количество фаговых частиц, чтобы на одну клетку приходилось меньше одной фаговой частицы.

Этим сводится к минимуму возможность множественного инфицирования. Затем, по прохождении этапа предварительной адсорбции, добавляют либо фаговую антисыворотку, либо, если фаг нуждается для адсорбции в двухвалентных катионах, хелатобразующий агент. С помощью обоих последних приемов в основном предотвращают инфицирование потенциальных трансдуктантов фагом, высвободившимся из реципиеитных клеток, которые были подвергнуты продуктивной инфекции. Трансдуктанты выявляют и пересчитывают, высевая их на соответствующие селективные среды.

В том случае, когда признак донора, по которому ведут отбор, рецессивен по отношению к аллелю реципиента н (или) обусловливает устойчивость к какому-либо бактерицидному агенту или веществу, посев делают не сразу, чтобы могла произойти сегрегация соответствующих признаков и они успели бы фенотипически проявиться. 83 чхсть и[ генетнкА 14.2.1.

Специфическая трансдукция (Е. со![' бактериофагом Л) Штаммь[ бактерии и фага Ввиду того что фаг Л обычно включается в хромосому Е. со!! между генами да! и Ь!о, в норме этим фагом трансдуцнруются генетические признаки, детерминируемые именно этими генами (4, 18, 22!. Траисдукцию можно продемонстрировать, взяв нелизогенный реципиеитный штамм с мутацией в гене да(, например штамм 6 (табл. 14.1) и штамм донора да![, например штамм 5 (табл. 14.1), подвергаемый лизогенизации фагом Л с1857. Последний несет мутацию, делающую температурочувствительным репрессорный белок, необходимый для наступления и поддержания лизогенного состояния: бактериальный штамм остается лизогениым, пока растет при 30'С, но индуцируется и лизируется с высвобождевием фага, если выращивается при 37'С.

Среды Используют супер-бульон (равд. ! 4.4.3), содержащий 10 мМ Мдг[-, лямбда-агар, или мягкий агар (равд. 14.4.2), агар ЕМВ (равд. 14.4.5) + !'7г галактозы (ЕМВ+Са!) или агар ЕМВ без добавок углеводов (ЕМВО), минимальный агар ЧВ (равд. 14.4.6)+0,5$> галактозы (МА+ +ба!) (и любые другие добавки, требуемые для роста данного реципиента) и водный раствор 10 мМ МпС!, (или Мд50.[).

Приготовление лизата трансдуцирую[цего фага Лизат трансдуцирующего фага легче всего приготовить следующим образом: сначала лизогенизировать донорный штамм фатом Л с1857, а затем вызвать его ливис. 1. Выращивают несколько миллилитров культуры донора в супер-бульоне при 37 'С до титра, приблизительно равного 1 10' — 2 1О' клетка7мл. 2. Добавляют около 200 мкл этой культуры к 2 мл расплавленного мягкого лямбда-агара, находящегося при 45'С, и немедленно выливают содержимое на по- 84 Н.

ПЕРЕНОС ГЕНОВ верхность лямбда-агара в чашке. Быстрыми движениями вперед-назад смесь с мягким агаром равномерно распределяют по чашке и Оставляют на несколько минут при комнатной температуре до затвердения нанесенного слоя агара. (Чашки с лямбда-агаром нужно довести до комнатной температуры или даже слегка подогреть, так как на холодном нижнем слое агара мягкий агар может затвердеть еще до того, как он равномерно распределится по поверхности.) 3. В центр чашки наносят две капли Л с1857-фаголизата, в которых содержится 10' — 10" пятнообразующих единиц (ПОЕ) в 1 мл. (Если Л-фаголизат хранился над хлороформом, то остатки последнего перед использованием удаляют инкубацией проб при 37'С с пропусканием время от времени пузырьков воздуха до тех пор, пока не будут больше выявляться пары хлороформа.) Крышку чашки Петри оставляют слегка приоткрытой до того момента, как нанесенные капли впитаются в агар. Чашку переворачивают и инкубируют при 30 С в течение ночи.

На следующий день на поверхности агара вырастает сплошной бактериальный газон с большим пятном в центре, вызванным лизисом некоторых клеток, инфицированных фагом Л с1857. Центр этого пятна, однако, будет замутнен вследствие выживания и роста донорных клеток, которые лизогенизировались фагом Л с1857. 4. Стерильной зубочисткой, деревянной палочкой или петлей отбирают некоторые колонии из замутненных областей роста в центре пятна и вносят их в супер-бульон (10 мл), находящийся в стерильной колбе Эрленмейера объемом !25 мл.

5. Инкубиру|от эту культуру при 30'С со встряхиванием и вращением колбы, чтобы добиться хорошей аэрации. Когда концентрация культуры достигает примерно 2 10' клетка/мл, увеличивают температуру иикубации до 45'С на 1 — 2 мин и затем вновь снижают до 37'С.

Продолжают инкубацию с аэрацией приблизительно 2 ч; за это время ливис должен пройти полностью. 6. Добавляют каплю СНС!м энергично встряхивают, чтобы она хорошо диспергировалась, и продолжают встряхивание при 37 'С в течение 10 — 15 мин, 7. Остатки бактерий удаляют из лизата центрифугированием при 6000 — 7000 и в течение 5 — 10 мин.

Над- ЧАСТЬ !П ГЕНЕТИКА осадочную жидкость сливают в стерильную колбу илн пробирку с завинчивающейся крышкой и добавляют еще одну каплю СНС!з. Определение титра фага Полученный Х с1857-фаголизат должен иметь титр около 10ш ПОЕ/мл; точно его определяют следующим образом. 1. Выращивают культуру в объеме 1О мл — либо нелизогенного штамма-донора, либо штамма-реципиента — в супер-бульоне с аэрацией пропусканием пузырьков воздуха или встряхиванием при 37'С до титра 1. 10' — 2. 10' клетка/мл. 2. Осаждают клетки культуры центрифугированием при 6000 — 7000 и в течение 5 — 10 мин и осадок суспендируют в 10 мМ МпС1ь 3.

Вновь осаждают клетки так же, как и на этапе промывания, и суспендируют осадок в 10 мл 10 мМ Мпс1,. 4. Оставляют суспензию в стерильной колбе Эрлен- мейера при 37'С в режиме голодания на 60 мин со встряхиванием. 5. Вносят в стерильные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм аликвоты суспензии объемом 1,9 мл и инкубируют их при 37'С. 6. Делают последовательные десятикратные разведения Х-фаголизата раствором 1О мМ МпС!ь 7. Добавляют в пробирки с находящимися в них при 37 'С аликвотами бактериальной суспензии по 100 мкл одного из следующих разведений лизата: 1О-', 10 ', 10 ', 10 '. После 10 — 15-мии преадсорбции отбирают из каждой пробирки по 200 мкл и смешивают с 2 мл расплавленного мягкого лямбда-агара, имеющего температуру 45'С.

Немедленно выливают получившуюся смесь на поверхность лямбда-агара в чашке, как описано выше. 8. После того как мягкий агар затвердеет, чашки переворачивают и инкубируют при 37'С. Целесообразно дублировать посев каждого разведения на тот случай, если в одной из чашек произойдет размазывание из-за избытка влаги. Надежнее всего 86 Ы ПЕРЕНОС ГЕНОВ титр определяют по результатам учета в чашках, где имеется не менее 50, но не более 400 стерильных пятен. Титр равен среднему числу пятен на чашке, умноженному на 100 и на величину, обратную тому разведению, по которому производили подсчет пятен. В случае определения титра лизата трансдуцируюгцего фага целесообразно отбирать и высевать некоторое количество лизата на чашку с агаром ЕМВ+ба1, чтобы убедиться в отсутствии жизнеспособных клеток донора. Описание метода специфической трансдук~!ии 1.

Выращивают реципиентный штамм с мутацией по гену да! в 10 мл супер-бульона при 37'С с аэрацией посредством пропускания пузырьков воздуха или встряхивания до титра 2.10' — 4 10' клетка/мл. 2. Осаждают, промывают и суспендируют клетки в 10 мл 10 мМ МдС!ы аэрирусмые клетки оставляют голодать при 37'С в течение 60 мин перед инфицированием. 3. Вносят аликвоты этой культуры (0,9 мл) в стерильные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм и инкубируют при 30'С. 4. Делают такие разведения лизата трансдуцирующего фага в 10 мМ МдС!м чтобы добавление 100 мкл к 0,9 мл бактериальной суспензии приводило к численным соотношениям, равным 0,1, 1,0 и 3,0 фага на одну бактерию. Остатки СНС1т удаляют из лизата пропусканием через него потока воздуха 5. Добавляют полученные разведения к пробам реципиентных клеток объемом 0,9 мл; одну такую пробу оставляют как контроль неинфицированной, чтобы убедиться в стабильности мутации по гену да! реципиента и в том, что число Йа!+-трансдуктантов превосходит число ба!+-ревертантов, обязательно появляющихся в тех или иных количествах.

6. После 10 †!5-мни предварительной адсорбции отбирают из каждой пробы 100 мкл и наносят на поверхность агара МА+ба! в каждую из четырех чашек. Для каждого варианта инфекции две чашки инкубируют при 30'С, а две другие — при 37'С. 7. Инкубируют чашки двое суток и затем подсчитывают число колоний с фенотипом Ста!+. 67 ЧАСТЬ 111 ГЕНЕТИКА Характеристика свойств трансдуктантов Для того чтобы охарактеризовать трансдуктанты, их следует отобрать и очистить, как это было описано выше.

Обычно для этого используют агаровые среды МА+Оа!, ЕМВ+Оа! среду Мак-Конки+Оа!. Чашки инкубируют при ЗО'С В качестве последнего этапа отбирают отдельные колонии каждого трансдуктанта в 2 мл супер-бульона и выращивают культуру при 30'С до концентрации 1 1О' — 2 !О' клетка7мл. Клоны Оа!", если их образование вызвано трансдукцией, должны обладать несколькими свойствами, выявление которых проводится следующим образом, 1.

Трансдуктанты должны быть лизогенны по отношению к дефектным и недефектным производным фага Х с1857, и поэтому оин не должны расти при 37 или 42'С. Чтобы проверить это, из каждой культуры отбирают петлей пробу, наносят ее на агар ЕМВ+Оа! в чашке и инкубируют при 37 или 42'С.

Характеристики

Список файлов книги