Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 27
Текст из файла (страница 27)
| ЧагйаЬ|е5 А!Тес!!од 1Ье Е11йсйепсу о1 Тгап51ес1йоп | ЧапаЫеа йа1 ай:ес( (сапа(ес(юп йпс(иде йе рип(у, 1оип, апс| атоип! о! 1Ье 06(А) 1Ье рН о1 йе 2х ВЕ5 Ьийег; апд йе сопсеп(га(юп о1 СОЕ |п |Ье |псиЬа(ог. ° |гири ге рйаат(д 0Ь(А5 (гап91ес( роог|у Ьесаиае о1 йе |пЬ|Ь||огу енес(9 о1 Ьас|епа( соп(ага|пап(в Еог й|9 геааоп, 1Ье Ьеа! гехи)19 аге оЬ|а|пед чдй асгири(оиа(у с|еап 06(А, рге1егаЫу рипдес| йгоидЬ арес|аИаед сЬгогпа1одгарЬу геа(па ог Ьчо гоипда о1 СьС( сеп1пддда1юп (рйеаае аее СЬарсег 1, Рго1осо(9 9 апс| 10). 6 ПЕСЕааасу, йЕ рйааГП(д сап Ье |иг(Ьег рипйес| Ьу рЬепо! юйого1огт ехсгас|юп |и йе ргеьепсе о1 1% (ччМ 505.
° 0пеаг 06(Аь у|еЫ чегу |о|ч !сапа!оста(йоп 1гес(иепсйех, регЬарх Ьесаиае 1Ье 6|о|ч 1огтадоп о1 йе са|с|- ип| рЬоарЬасе-0НА соргес|р|(а|е (еачеа йе 06(А ехроаед 1ог |опд рег(ода о1 Игпе 1о сеИ пис|еааев ° ТЬе па1иге о1 йе ргесйрда1е 39 а7(ес7ес3 Ьу 1Ье апюип1 о1 0|4А иаед.
А!гапябоп (чь|Ые ипдег йе инсгоьсоре) 1гогп а соагае ргес|р((а1е (о а Йпе ргес|рйа1е осси!9 а1 йе ордгпа| 06)А сопсеп1гадоп (и|ваИу 2 — 3 пап! |и (Ье дгочч(Ь п|ес|вп|). ТЬе ордгпигп 06(А сопсеп|габоп епсогпраааеа а паггочч гапде апд ьЬоийд Ье де|еип|пес! егпр|псаИу 1ог |псйчс|иа| сеИ диев ° ТЬе 9|о|9 1оипабоп о1 |Ье са|свт рЬоарЬа(е-0НА соргес|рда1е гес|ин еь а 93)дЬ((у асЫ|с рН апд |псиЬасюп |п ап аипоарЬеге соп(а|п|пд йосч сопсеп(гадопх О1 СО . ТЬе рН сигче 39 чЕГу 9Ьагр ед(Ь а с|еаг|у дедпед орбивп| ас 6.96, ччЛегеаа(Ье СО сопсеп1га|юп 'ь орбгпа| Ьепчееп 2% апд 4%.
СЬеп алд О|сауагпа (1967) герог|ед !Ьа( (Ьыпе(Ьод сои3с| Ье ихед 1ог (гапайеп( апайуа(9 о1 депе ехргеа- 9(оп апс3 йа1 йе 9(тий(апеоих |п(гос|ис|юп о1 Ьчо ог гпоге р(астйда гес|исед йе очегаИ ед|сйепсу о1 1гапа1ес|юп. ТЬе очегаП 1гес|иепсу |чах 9633 гписЬ Ь|дЬег (Ьап 1Ьа( оЬ(а|пед ед(Ь о(Ьег са|свп| рЬоарЬа(е гпе(Ь- осЬ. ЧЧЬеп со!сапа)ес(йпд ед(Ь а ае(ес|аЬ|е таг|сег, И |9 и|ваИу песеахагу !о ордтые йе хугдеп| на(пд инхсигех сои!а |и | пд ййегеп| гас(па о1 рйаагп! да сапу | пд йе хе! ессаЬ|е гпаг|сег о1 |Ье депе о1 йпсегеьс (е.д., 1:2, 1: 5, апс| 1:10), Адд|Нопа! Ма!еда|5 2х ВЕ5-Ьи)Тегес) ха7|пе (ВВ5) 50 |пи ВЕ5 РЧ,Х-Ых(2-ЬудгохуесЬу!)-2-а|и(иое|Ьаиехн)(оп(с ас|й 280 и|м НаС! 1.5 тв На,НРО,-2Н,О ОьюЬе1.07 до1ВЕ5, 1.6 до1 ГчаС), аид0.0275 о1На,НРО |и а !оса| чо|и|пео1 90 |и| о1ди66ед Н О.
Ад|иь1йе РН о1 йе со(нсюп со 6.96 |ч|й НС! аС гоои| сегирегавге, аис| йеп ад|нь1 1Ье чо|игие |о 100 и|! |ч|й д|ьВПед Н,О. 51епрае йе хо(ндои Ьу рахх|ид |1 |ЬгондЬ а 0.22-и|и ЙЬег; х!ого йе ЕЫа!е |и аЬцнои ас — 20'С. СаС|, (0.25 М! Одао(че(,1,.(С.С|,.ЬН,О|. 20 |и!.(д|ЕИИ д НО.5(егИ(сей, ю)~|оп Ьу Р~'ид(1!Ьгондп а022 „т 6(!ег5(.ге йе 631га1е |и 1-гп| аЬциоь а1-20"С. ! 5ирегЬе!|са! р!аьт|д ас 7 Рд)и) |и О. 7х ТЕ (рН 7.6) | Тгххие си|1иге с ВЬеа 190-тгп) ТЬВ рго|осо! Ь дех(диод 1ог се|В дгон~п |и 90-ичп о||иге ййек 6 ойег спн(дччеИ р|асев Иаьй, ог сйеЬеь о1 а йбегепс йап|е1ег аге иьед, сса(е йе сеИ денису аис| геадеиС чо)и|пес ассогд)ид(у.
Р)еие ьее ТаЫе 16оп е1Ьод Т|ч|епсудоиг Ьоигь Ье1оге !сапа(есбоп, Ьагчегд ехропеп6аИу дгоедпд се(35 Ьу (гура|и|ха(юп апд гер|а(е а|кузой о1 5 х 10с се|К оп|о 90-гпгп 69|ве си||иге д(5Ьеа. АсЫ 10 гп| о1 согпр|е1е дгомаЬ гпейип7, апс| |псиЬа1е йе си||игеа очегпйдй а| 57'С |и а ЬиинсИес| |псиЬа1ог ед|Ь ап а(тоарЬеге о1 5 — 7% СО,. 16.20 СЬареег 1б| !и(гадис(пе С1опед Сепеь т(о СиВигед Мати|а!|ап Се11ь 2. М(х 20-30 щ о1 ьирегЬейса| р|аьгпЫ ОЬ(А ед(Ь 0.5 гп! о1 0.25 м СаС|,. АсЫ 0.5 гп! о1 2 ьайпе (885! апд |псиЬа(е |Ье го|х(иге 1ог 10-20 и Ппи(еь а( гоогп (егорега(иг.
Оо по( ехрес| с|рйа(е (о 1опп диг(пВ (ЬВ ((гпе. 3. АсЫ |Ье СаС! -ОЕ(АВВ5 ьо|и!юп |Ьорв Ве (о (Ье д(ьЬеь о1 сейь, ьчч(гйпц цепду |о пмх чче си((игеь Еог 15-24 Ьоигь а( 37'С |п а ЬигпкИед |псиЬа(ог |п ап а(гпоьрЬеге о1 2 — 45й СО, 4. Кегпоче |Ье тедюгп Ьу аьр|га(юп, апс3 ппье |Ье сейь Ьв|се вой Ь гпед(оп с АсЫ Т 0 гп| о1 поп ит, апг! |псиЬа(е (Ье си((игеь 1ог 18 — 24 Ьоигь а( 37'С |п а ЬигпЫ|йед |псиЬа(ог |п ап а(гп СО,. 5.
Гойовдпц Т 8-24 Ьоигь о1 |псиЬа(юп |и попье|ес|гче гпе|йигп, (о айов ехргеьь(оп о((Ье (гап (о осси г, (гурдп |хе апс1 гер|а(е |Ье сейь (п |Ье арргорпа(е ье(ес((че гпедюп с СЬапее |Ье ь игп в((Ь саге ечегу 2 3 дауь 1ог 2 — 3 и еейь (о гегпоче (Ье с|еЬгВ о1 с1еад сейь апд (о айо гель(ап( сейь (о огоев ТЬе д((иг(оп а( в Ькй (Ье (гапь(ес(ед се|В ьЬоиЫ Ье гер|а|ед |о у|е|д ве(3-ьерага|ед со|оп|еь Ь де ей(с(епсу о1 ь|аые иапь(оггпа3(оп, ъчй(сй сап чагу очег ьечега| оЫегь о1 гпайп((иде (е.й., р(еаье ьее ЧВ(й(о (984|.
ТЬе е%с(епсу Ь дерепдеп( оп |Ье геар|епг сей гуре (ь|йп(ЕкапС гййегепсеь Паче Ьее Ьеьчееп гййегеп| с|опеь ог д(йегепе раььайе питЬегь о1 |Ье ьате сей йпе |Согьаго апд геагьоп а|. 398533, |Ье па(иге о1 (Ье |п|годисед Пепе апд |Ье ей(сагу о1 (Ье |гапьспрйопа| соп|го| ь(йпаЬ аь апс| |Ье агпоип| о( допог (33(А иьед (п |Ье |гапдес|юп. б. ТЬегеайег, с|опе |псйчЫиа| со|оп|еь апд ргорайасе Еог аььау (Еог гпе(ЬогЬ, р|еаье ьее 1айоЬу апс| Раь(ап, 1979 ог 5рес|ог е( а!. 1998Ь [СЬарсег 86 |п Се|(ьг А (аЬога(огу Мапиа|!3.
А реггпапеп( гесоп| о( (Ье пигпЬег оЕ со|оп|еь гпау Ье оЫа(под Ьу йх|пй |Ье гегпа(п(пй се((ь в(ЕЬ ке соЫ гпе|Ьапо| ! Еог 3 5 гп(пи|еь Еойов ад Ьу ь|а(п(пй в((Ь 104 С(егпьа 1ог 3 5 пмпигеь а| гоогп Еегпрегагиге Ье|оге ппяпй |п |ар в а|ег. ТЬе С|егпьа аа(п ьйоиЫ Ье Егеьй|у ргерагед |п рЬоьрйа|еЬийегед ьайпе ог Н О апд ййегед (ЬгоийЬ ЪАЬаггпап Е(о. / | 53гег рарег Ье(оге иье. 16.22 СИаргег !б: 1 пи ог)ис!по С!олег) Сепах тго Сиlгигег) АЕагпгпа1!ап Се!!г НЕРЕ5-Ьилегес) хайле 2! шм НЕРЕ5 0.7 шМ Ха НРО„ 137 шм ХаС! 5 шМ КС! б гпм бехсгоае Ас))оас йе РН оЕ йе ао1шюп со 7.!О.
5сеп1ые йе ао1шюп Ьу б!сгабоп апс) асоге Егохеп сп 25 — 50-сп! а1!9аоса. ТЬаю а !теаЬ а1крсос Ьеуоге еасЬ сгапауесс!оп апс) сЬес)с йе РН оЕ а япа11 чо1шпе. Кеес))пя РН !Е песеааагу со 7.!О. !ьоргорало! А)аС! ЕЗ м) 5сег!!!ае Ьу 61сгабоп, апс) яоге ас гоогп сешрегашге. Ь)пс!е1с АСЫВ апд О1фоппс!ео1Ые5 Селит!с ЕЗАЕА Ргераге Ь!ВЬ-шо1еса!аг-юесцЬс РХА !и ТЕ Егош арргорпасе се11а аа с)еасг!Ьес) ш СЬарсег 6, Ргососо! 3.
Р!!иге СЬе РХА Со 100 иВ)ш! сп ТЕ !РН 7.6). Арргохппаге1у 20-25 иВ оЕ Вепоппс РХА ы гес)о!гес) Со !гала!ее! еасЬ 90-шпс р!асе оЕ сп1спгес) се11а. ТЬе аепоппс РХА пшас Ье аЬеагес) со а яге галсе оЕ 45 — 60 )сЬ Ьеуоге иа!пВ Ь со сгапаЕесс сеПа !Р!еаае аее 5сера 2 апа 3). ТЬе арргорпасе сопс)!с!опа Еог аЬеаг!пВ сЬе Вепогп!с РХА аге Ьея с)есепп!пес) 1п рге1ппш агу ехрепшепса аа Ео11оюа: Ясеаг 2-ш1 а!ирюи оЕ Ь!цЬ-шо)есп)аг-сге!ВЬс РХА Ьу раас!пВ еасЬ а!нрсос сЬгопВЬ а 22-ВапВе пеес)1е Еог а с)арегепс пшпЬег о! бгпеа (е.В., сЬгее, Еош, Вче, ог ях бгпеа). Ехагпше сЬе РХА Ьу е1ессгорЬогеяа оп а 0.696 Еса)г) ацагоае Ве1 Ео!1оссес) Ьу аса!п!пВ са!сЬ есйег ейЫ- шгп ЬгошЫе ог 5УВК Оо!й Аа гпаг1сега, ше пюпогпепс апс) йпсепс Еогша оЕ 1спеаг Ьассег!орЬаВе а РХА.
То орсипые сЬе геша!п!пц асеря аЬеагес) РХА оЕ сЬе ргорег аае аЬоп10 сЬеп Ье са1сеп сЬгопВЬ 5сер 9 оЕ йе ргососо1 па!па с)!аЬеа са!сЬоцс се11а. Р!аьтгс! си)гИ ае!есгаЬ!е таг)сег Орпопа1, р1еаае аее по!ее со 5сера 3 апс) ! 2. Мее11а Се!! си!гиге агоисгИ тес)!ит Есотр!его алс! хе!есггие) йрес1а! Е41о1р!пеп$ Ро!уегИу!еле гиЬех 112-глЬ 5ИерИегсГа сгоо!с 5!1!соп!гес) д1аы Раасепг рсрессе солса!п!пВ а Ьоо)с ас сЬе епс1. Т!55ие си!гиге с)!5Иех 19О-тт! Се!15 апе1 Т155пе5 Ехролелба!!у агосо!ла сиlсигех оЕ татта!сал се!!5 МЕТНО0 1. Ои с)ау 1 оЕ йе ехрегииепс, р1асе ехропепс)а11у агоса)сса сеПк Ее.а., СНО се!15) ас а с1епясу оЕ 5 х 105 се!16 рег 90-иии си1сцге с)ыЬ си арргорпасе агосасЬ тес)1шп со!с!а)п)иц аегши. 1псиЪасе йе си1сигеа Еог -16 Ьоига ас 37'С )и а Ьиппс)16ес) спсиЪасог ъчсЬ ап астоарЬеге ОЕ 50/О СО2.
2. Оп с1ау 2, аЬеаг аи арргорпасе атоипс оЕ Ь)аЬ-то1еси!аг-схе)аЬс Е)ХА си!о Егаатепса гала)ла си же Егот 45 )сЪ со 60 )сЪ, Ьу рааяпа )с сЬгоиаЬ а 22-хапае пеес)1е Еог сЬе ргес)есегпцпег) пшиЪег оЕ Нисеа (р1еаае аее сЬе лосе со сЬе Сепоиис ЕсХА епсгу аЪоче )п Масепа)5). Се!!а аЬоиИ Ье сгапасессес) ю!сЬ 20 — 25 05 оЕ Вепоппс РХА рег 90-ипп с)!аЬ. РтестрКасе сЬе яЬеагес1 Р)с)А Ьу айй)пП 0.1 чо1шпе оЕ 3 М ХаС! апс1 1 чо!цспе оЕ )яоргорапо1.
СоПесс СЬе РХА оп а 5ЬерЬегй'я сгооЫ Ргаш 1Ье ргестрКаге ЬпеЕ)у аПа)пят СЬе яЫе оГ СЬе тцЪе апс1 сгапяГег Ь го а яесопс1 сцЬе сои!а)и)пП НЕРЕ5-ЬцЕГегей яа1)пе (! гп1 рег 12-15 )сК оГ РЫА). Кейяяо!че 1Ье РХА Ъу цепс)е гогаНоп Гот 2 Ьоцтя ас 37'С. Ма)се яцте сЬас а11 оЕ сЬе Р)я!А Ьая йяяо1чей ЬеЕоге ргосеей!па.
СЧЬеп сосгапяуессшП гчгсЬ а яе)ессаЫе юаг1сег 1Р1еаяе яее сЬе поте Ье!ояч 5сер 12), асЫ со гЬе аепошсс ЕгХА а ясеп1е яо!ццоп о! сЬе арргорпасе р1аыпЫ го а Ппа1 сопсепсгагюп о! 0.5 ца/гп1. ТгапяЕег 3-ш1 а11с)цогя оЕ яЬеагей аепотп)с Р)Я!А )пго 12-ш1 ро1уеСЬу!еие СцЬея (опе а1)с)цог рег ссчо йяЬея со Ье сгапяЕессей). ТЬе пшпЬег оЕ гЬяЬея тес)шгей апй сгаыуессапь оЬсагпей чйП гагу Егош опе сеП 1спе со апосЬег апй оп сЬе ейкгепсу оЕ сЬе яе)есйоп шейюй.
Ая а ашйе, -15 — 20 йяЬея оЕ СНО сеПя пшяс Ъе цапяуесгей го оЬгаш 3 — 10 ягаЫе пацясоппапь. То Еогтп сЬе са1сшгп рЬоярЬасе — РХА соргес)рЬасе, цепс!у чотсех ап а1прюс оГ яЬеагей аепош)с Р)х)А, апс1 асЫ 120 р1 оЕ 2 М СаС1 10 а с1горъч)яе ГаяЬюп. 1псцЬаге СЬе гцЬе !ог 15 — 20 пппцтея ас гооти Сетпретагцте. ТЬе яо1цйоп яЬоц!й сш'и Ьагу, Ьш и яЬоцИ пот Еопп ч!яйЫе сЬлгпря оЕ ргесгрцасе. Аярпате 1!те шейшш Етош Ссчо йя!гея оЕ се!1я (Егош 5тер 1) апй аегг11у асЫ 1.5 и) оЕ 1!те са1- сштп рЬоярЬасе-РХА соргесгрйасе со еасЬ й)яЬ.
СагеГц)1у госасе сЬе йяЬея го ясч)г! сЬе шейшп апй артеага сЬе ргестрЬасе очет ЕЬе птопо1ауег оГ се!Ьц !псцЪасе сЬе се11я Гог 20 иип- цсея ас гоош сегпрегасцге, гога!)па ЕЬе йаЬея опте йцппа сЬе ЕпсцЪаНоп. Сепс1у асЫ 10 гп! оЕ ччагтпей (37'С) агоччсЬ гпейшп со еасЬ йяЬ апс1 гпсцЬасе Еог 6 Ьоцгя ас 37'С 10 а Ьцш)й)Егей 1псцЬасог ъч)сЬ ап аспюярЬеге оЕ 5% СО .
Кереас 5серя 5 — 7 пи!11 а11 оГ сЬе йяЬея оЕ се!1я сопса)п сЬе са!сшит рЬоярЬасе — РЫА ргес)р- Касе. АЕсег 6 Ьоцгя оЕ спсцЬасюп, ехаиппе еасЬ йяЬ цпйег а 11аЬс ппсгоясоре. А "реррегу" ргестртсаге яЬоц!й Ье яееп айЬет)па со сЬе се11я. ТЬе ргес)рпасе яЬоц1й Ье пеКЬег соо Гспе пот с!шпру. Ехрепепсе чйП гПссасе Ьосч а "реррегу" ргес)р)саге 1оо!ся цпс)ег сЬе пцсгоясоре. Теппгпясе сЬе ехрепшепс гчсгЬ се)Ь П а чету Ппе ог с1шпру ргесгрпасе гя чппа!ггес1 ас сЬся ясер. ТЬе Еаг1цге со Еопп а реррегу ргессрггасе ас гЫя ясер ог а Ьасу яо1шгоп ас 5сер 5 соц1й Ъе йце со сЬе цяе оЕ а НЕРЕ5-Ьцууегей яаПпе яо1шюп оЕ цпргорег РН, ап очес!у 1опа гпсцЬайоп аг 5сер 5, ог а юЬорСцпя) сопсепггаеюп о! СаС1, ог РЬСА. 1п тпояс саяея, сгеациепс сч)сЬ П1усего) ас сЬ)я ясер сч!!! епЬапсе сЬе сгапяГесНоп Егес)цепсу.
То яЬос1с сЬе се11я сч)сЬ 01усего1: 1О а. Аяртгаге СЬе тпейшп сои!а)п!пП 1Ье са!сшгп рЬоярЬаге — РХА соргес)р)гаге. Ь. То еасЬ йяЬ оЕ се!!я, асЫ 3 тп1 оЕ 15% П!усего1 ш 1х НЕРК5-ЬцГГегес1 яа1спе 1Ьаг Ьая Ьееп счаппей со 37'С. 1псцЪасе Еот по !опеег Яап 3 ттигея ас тоопг сешрегасцге. 1г гя цпропапс сЬас сЬе 01усего! гп сЬе НЕРЕ5-Ьцууегег) яа1гпе цог Ье 1ей гп сои!асс чйсЬ сЬе сеПя Еос соо !опа. ТЬе оргцпцш снпе репой ыцаПу храпя а паггою гапае апй чапея Есош опе сеП 1гпе со апогЬег апй Ьопг оце 1аЬогапггу со сЬе пехс. Рог сЬеяе геаяопя, сгеаг оп1у а Ееяч гПяЬея яг а сапе апй са1се гпю яссоцпс сЬе !епа!!г ос йгпе со аярЬасе гЬе а1усего1 ю сЬе НЕРЕЯЬцууегей яаПпе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
