Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 90
Текст из файла (страница 90)
со!! Г' зсга)л рог а !!зс!п3 оГ ягашз зоиаЫе Гог йе ргорацассоп оГ Ьассег!орЬаае М)3, р!газе зее ТаЫе 3-2 сп йе !псгодаес!оп со сЬ)з сЬарсег. МЕТНО0 1. Ргераге зсос)сз оГ риса!)че гесошЬшапс ЪассепорЬаВез Ггогп япа!е р1адпез, Вгосчп ш ап арргорпасе Р' Ьозс, аз с)езег)Ъес) сп Ргососо! 2. Аз гоп!го!з, ргераге зсос)сз оГ зечега! попгесотЫпапс ЬассегюрЬааез Грк!сег! Ггот аз!1-сзо!асег) с)аг)с Ыае р!адаез). 2. с)зе а ппсгор)рессог ъч)сЬ а зсеп!е с)р со сгапзуег 20 )с! оГ еасЬ оГ сЬе зпрегпасапь 1псо а ГгезЬ ш)сгоупае шЪе.
5соге йе гепса)пс1ег оГ йе зпрегпасапь ас 4'С оп!11 пеес)ес). 3. То еасЬ 20-)с! а!едпос оГ зпрегпасапс, асЫ 1 )с! оГ 2ага Я)5. Тар сЬе яс!ез оГ сЬе СпЬез со ппх сЬе сопсепсз, апс) йеп 1пспЬасе йе спЪез Гог 5 пппшез ас 65'С. 4. То еасЬ сцЪе, ас)В 5 )с! оГ ятгозе ае1-!оас!1пВ ЬпГГег. АВа!и ппх йе сопсепсз оГ сЬе спЪез Ьу сарр)пВ апс1 йеп апа1уке еасЬ загпр1е Ьу е1ессгорЬогеяз сЬгопаЬ ап 0.7ага ааагозе ае1. сспп йе це1 ас 5 сгусш.
Аз роя!)не сопсго!з, пзе япа!е-зсгапс)ес) Г)ЫА ргерагас)опз оГ ргечюпз!у сЬагассег)лес! М13 гесошЬ)пап!а йас саггу Гоге)ап зедпепсез оГ 1спосчп яке. Е!ессгорЬогез!з ас !осч чо!саде е!!гшпасез ргоЫетз аззос!асег) гВГЬ за!с Йоль сгеасес) сп сЬе це! Ьу сЬе !аг3е чо!ате оГ загар!е. 5.
сАсЬеп сЬе ЬгошорЬепо1 Ыпе Ьаз сгаче1ес1 ГЬе Ео!1 1епасЬ оГ сЬе ае1, РЬосоагарЬ сЬе РХА ппс1ег ГЛГ 111пш)пас)оп. 6. Сошраге сЬе е1ессгорЬогеск гпоЬ|11с)ез оГ йе япа!е-зсгапс)ес) Е)ЫАз 11Ьегасес! Ггош йе ршаВче гесошЪ|папсз сч)сЬ сЬозе оГ сЬе Е)ЫАз 11Ъегасес! Ггогп сЬе сопсго! попгесошЬ)пап! Ьассег)орЬацез. ТЬе з)п3!е-зсгапс)ег) РЫАз оГ гееогпЬшапь саггу!п3 зедаевсез оГ Гоге!3п Р)4А !опцег йап 200 — 300 псю!еоссВез т)3гасе з)!аЬс!у тоге з!осч!у сЬап егпрсу чессог сЬгоацЬ 0.7ааа ацагозе ае!з.
Опсе гесотЬшапсз оГ сЬе Вез!гед яае Ьаче Ьееп гаепсГВеа, яп3)е-зсгапс)ес) Р)4Аз сап Ье ргерагег) Ггопс зорегпагапСз згогег) аг 4 С !5Сер 2). 7. 1Г песеззагу, сопГ)гш йе ргезепсе оГ Гоге)ап 13ЫА зедпепсез Ьу сгапзуегг)па япа1е-зсгапс)ес! Е)ХАз Ггогп сЬе ае! со а п)сгосе1!п! озе ог пу1оп псешЪгапе (р!еазе зее СЬарсег 2, Ргососо! 21) Ргогосо! 71Аиа!узгз оЕйееотЬгпапс Ваесег(орЬаее М)3 С)оиез ЗАТ апд ЬуЬг)д)к)пц (о ап арргорпасе гад)о)аЬе)ед ргоЬе (р)еазе зее СЬарсег 2, ргососо! 22).
Боа)с йе ке! ш $0 чо!пшез оЕ 2()х ЯС Еог 45 пипи(ее, апс! йеп 1гапзЕег (Ье 0ХА гВгес(!у 1о (Ье шешЬгапе. ТЬеге Ь по пеед го депатге 1Ье 0$4А Ьу зоа)дпИ 1Ье Ве! гп а)Ка)Ь 5оийегп Ыосппц ияпВ о((Копие)еог(де ргоЬез ы рагггси)аг)у нзеЬВ гп (деп1$(у(пВ гесогпЬгпапь сап угпВ д(йегепг зсгапдз оЕ а гагВег 0)з(А. АЕТЕ$$Ь(АТИЛ(Е РВОТОСОЕг БС$($ЕЕЬ)$(з(С ВАСТЕР)ОРНАСЕ М13 РЕАО$3ЕВ ВТ НТВВ$0$ХАТ(ОЬ( Вассег(орЬаке М13 р)аг)иез сап Ье зсгеепед Ьу ЬуЬг(д)аа()оп (о гоР-(аЬе)ед ргоЬез Ьу (оИои(п6 еззепба((у йе зате тейосЬ дечзед (ог зсгееп(пк ЬасЗегюрЬаке ) Ме1Ьод 1. Тгапзуег (Ье Ьас(ег(орЬаке ОЬ)А 1о а ппгосе))и!озе ог пу)оп ИЬег аз дезспЬес! (п СЬар(ег 2, Рго1осо! 21. 2. Айег гепючпц йе 6Ьег (гогп йе зиг(асе оЕ (Ье акаг ог акагозе, а((озч $1 (о дгу (ОЬ(А з(де ир) а( гоогп сегпрега1иге.
) Ье з)пВ(е-з(гапдед ЬасзегюрЬабе М1 3 ОЗ(А сгапз(еггед го (Ье 6$1ег доез по( пеед 1о Ье депа(игед зз((Ь а(Иа(И 3. ВКЬе йе 6$(ег ипс$ег часиигп (ог 2 Ьоигз а( 80'С ог аисос(аче 1ог 3 гп)пи(ез, ог, гп йе сазе о( пу)оп 6$(егз, ехрозе 1о $ з)(ггад)а1)оп 1о 6х (Ье ОЫА 1о йе 6$1ег (р)еазе зее СЬар1ег 2, Рго1осо! 21). 4.
НуЬпд)ге йе пппюЫ)ыед ОЫАз (о ал арргорпасе ззР-)аЬе)ед ОЬ(А ргоЬе аз с(езспЬес$ )п СЬар1ег 2, Рго(осо! 22. ОоиЬ(е-з1гапдед ОНА ргоЬез зз($$ ЬуЬпг)ае 1о аИ М13 гесогпЬ(пап(з 1Ьа1 саггу йе 1агВе1 зег(иепсе згезрессве о( йе опепгадоп оНЬе зеКтепс ос (оге(Вп Ой(А зз)И 6(п 1Ье чыог 5(пВ(ез|гапдед ргоЬез хи И ЬТЬг(д(зе оп(у 1о гесогп- Ь(пап1з 1Ьа( сапу согп р)егпеп1агу зег(иепсез аиасЬед 1о (Ье (+ ) зиапд ос М13 ЬасзегюрЬаВе ОЗ(А. 6 1Ье 6$1ег ь 1геа1ед зз(й аИгаИ, аз (п сопчепдопа( Веп(оп Оачь зсгееп(пВ ос р(аг(нез, доиЬ(е зиапдед М(3 КГ ОЫА гз(еазед (гот (Ье (п(есзед Ьасзепа в 6! Ье депаюгед.
Вой йе (е) апд ( — ) зггапгЬ ос М1 3 гесотЬ(папи Феге(оге Ьесогпе анаИаЫе (ог ЬуЬпд(гас)оп. Впсе 1Ье агпоип1 о( Н-) зиапд аиасЬед 1о 1Ье Всег В гписЬ Вгеа(ег 1Ьап йе агпоип1 Ы КГ 0(з(А, яппи(Изз(гапдед ргоЬез согпр)етепсагу 1о (Ье (+) зиапд зз($$ Вепега1е а тосЬ зиопбег ЬуЬг(д(хаг(оп з(Впа(1Ьзп ргоЬез согпр1егпепгагу 1О (Ье (-) зсгапд. А зсеаК ЬуЬпсИгадоп з)Впа( ъз(1Ь а з(пВ(е-зггапдед ргоЬе ыиаИу гези(и сгот ЬуЬпд(заг(оп оНЬе ргоЬе го депа(игед М(3 Кз ОНА (п р(аг(иез йа( сопга(п Фе (пзегс (п 1Ье орроя1е опеп(а1юп.
ТЬЬ д(6егепсе (п (псепз(су о( ЬуЬг(д(за()оп Ьаз Ьееп изед аз а гпейод 1о аззау 1Ье опепга1юп о( допед (пзеггз (Р(с Кеп 1990). Рго1осо! 8 Ргодис~щ 5~пц! е-Мгапдед 0МА ЫЙ РЬацегпМ Чес1огь р НАСЕМЕР5 ГЕРС!тОияЛ СОМВ!МЕ РЕАТРКЕ5 Ор РСАЗМ!Р5 апс! 62!ашепгопз Ьасгег!орЬааез.
5сг!ррес! со сЬесг Ъаге еззепс!а)5, ТЬезе чессогз аге сопчепсюпа1 Ь!ВЬ-сору-ппшЬег р1аяп!с(5 ЕЬа! саггу а шос!!6ес) чегяоп оЕ ТЬе ша) ог !псегцепгс геВ)оп оЕ а 6!ашепсопз Ьассег)орЬауе (р1еазе зее ТаЫе 3-4). ТЬсз геВ)оп (508 Ър ш 65 сч!!о-суре Еопп) епсос!ез по ргосе!пз Ъ|лс сопсаспз аП оЕ ТЬе с(з-асс!па зес)пепсез ТЬас аге !пс!!зрепзаЫе Еог !и!с!ас!оп апс! сеппша6оп оЕчсга1 !3)з)А зупсЬеяз апс! Еог пюгрЬоаепеяз оЕЬассег!орЬаае раг6с!ез. ТАВЕЕ 3-4 РЬаВешЫ5 !мтеаоем1с Вессом НесРеа Чсап5 НО5т ВАстеа1А ссеееаемсе РЕАЕМ10 рЕМВЕ (йегпей !гого р1)С8) РепСе ег а!. (1983) 1К!, ап шсег1егепсе-геязсапс чапап1 оЕ Е15 71/18 РВЗА101 (йеггчей Егогп а ЧХ') а чапапс оЕ М13 геязсапс со шсег- Еегепсе Ьу р1аяп!йз сопсашспв сЬе М13 спсегвешс гевюп Ееч)пзоп ес а! (1984) М13 Х5127, Х5101 Ч(е!га апй Мезяпв (1987) р()С118Л 19 (йепчей (гоп! р(1С18Л 9) М!ЗК07 сагпез а пппасейчегзгот оЕ вепе П сваг асог)сз 1ея сче!! оп сь осчп спсегвепгс гев)оп сЬап оп сЬас с!опей (п рРС118! 119 М13 МЧ1184 5Ьогс ес а1 (1988) Ясогс ес а1.
(1988) рВ!пезспрс рВ!пезспрс 11 5К -Н- рВ5 3-)- Х1.1-В!пе ХМ-В1пе МКГ Х!.1-В1пе МВГ Е1 М13К07 К408 ог М1ЗК07 К408 ог М13К07 Е1 А16пв-Меез апй ВЬоп (1989) А)с(пв-Меез апй ВЬогс (1989) Х11-В!пе МРР' рВС 5К е)— К408 ог М13К07 рСЕМ! 1ХЕ(с) рСЕМ 1ЗХЕ(с) М13К07 ог 8408 М13К07 ог 8408 РН115, )М! 09 РН! 15, )М109 Освег тоге сотрвсасей РЬааетсй зузсетз Ьаче Ъееп йеч!зей (е.8., р!сазе зее Ое!йег ес а!. 1985! Меас1 ес а!. 1985; Реесегз ес а!. Г985).
'Р1еазе зее Таяе 3-2. зЕпеа апй 2)пйег(1982). '5еей (1983). 3.42 Ргогосо! 8: Ргодистд 5гп8!е-лггапдед РХА ъчЕгй Рйа8ет!д Ъесгогл 3.43 5е8тепга оЕ Еоге)8п РХА сап Ъе с1опед Еп рЬаВет!да апд ргора8асед аа р)аат!да лп йе иаиа! ъчау. Ноъчечег, ъчЬеп а та!е алга)п оЕ Е. сой саггу)п8 а рЬа8етЫ ь !пЕесгед ъч!гЬ а аи!гайе 61атепгоъь ЬассепорЬа8е, йе плоде оЕ гер1кабоп оЕ лЬе рЬа8егпЫ сЬап8еа ш геаропае со Вепе ргодисга ехргеааед Ьу гЬе )псопип8 члгия ТЬе Вепе 11 ргогегп епсодед Ъу йе Ье1рег ч!гиа !пггодисеа а пк1с аг а арес)йс яге гп гЬе шгег8епк ге8!оп оЕ гЬе рЬа8егпЫ апд Ьепсе )п!г!асеа го1!!пц слгс1е гер1лса6оп (Вес)ъ апс1 Хш)ъ 1981; Робо ег а!.
1981а), ъчЬгсЬ Вепегагеа сор)еа оЕ опе аггапд оЕ йе р1аяпЫ Р)ъ)А. ТЬеае яп8!е-ягапдед сор)еа оЕ йе р1аяпЫ РХА аге рас)га8ед !псо рго8епу ЬассегюрЬа8е раггк1ея ъчЬлсЬ аге гЬеп ехггидед !пго йе мопед!ит !Ропо ег а1. 198 !Ь; Репге ег а1. 1983; 1.елпаоп ег а!. 1984; Ха8ига)су апд Веппап 1984; Се!дег ег а1. 1985; Меад ес а1. 1985). ТЬе весгесед рагг!с!еа сап еая!у Ье гесочегед Ъу ргес)рйагюп чдгЬ ро!уегЬу!епе 81усо! апд гЬе яп8!е-аггапдед Р)ъ)А рипйег1 Ъу ехггасбоп ъч!гЬ рЬепо1 (Ргогосо! 4).
51п81е-ягапдед РХАа ргодисед Ьу рЬа8ет!да аге гьед Еог йе аате ригроаеа аа яп81еаггапдед Р)ъ)Аа оЕ ЬасгепорЬа8е М13 гесогпЪлпапгя Еог РХА аег)иепс!п8, Еог гЬе аупгЬеяа оЕ аггапд-арес!Ек гасйо1аЬе1еъ1 ргоЬея Еог аиЬггасг!че ЬуЪг!д)айаг!оп, апд !ог о118опис!еог!десйгеслег! пшла8епеяя 1п агЫгйоп, рЬа8ет!д чесГогь сап Ье иаед лп арргорпаге а!ганы о ЕЕ. сой (е.8., Въъг3!3) го ргодисе яп81е-ягапдед Р)ъ)Аа гЬаг сои!а!и огас!! гп р1асе оЕ а ргороггюп оЕ гЬе гЬупипе геаЫиея ТЬеае огас!1-аиЬаг!гигед Р)ъ)Аъ аге ехсе11епг аиЬаггагеа Еог сеггалп суреа оЕ о118опис1еог!де-д!гесгед тига8епеяа (р!еаае аее СЬаргег 13, Ргогосо1 1; МсС1агу ег а1. 1989). РЬа8етЫа Ьаче аечега! аигас6че Ееагигеа гЬаг очегсоте ргоЫета сопппоп1у епсоипсегед ъч!ГЬ с!оп!п8 лп ЬасгепорЬа8е М13, !пс!ид!п8: ° а роябче ае1есгаЫе таг1сег йаг сап Ъе ъьед го ае1есс Ьасгепа сгапаЕогтед Ъу гЬе рЬа8егпЫ ° ЫВЬег у)е!да оЕ доиЫе-аггапдед Р)ъ)А ° ейпппабоп о! йе г!те-сопаит)п8 ргосеаа оЕ аиЬс!оп)п8 РХА Ега8тепга Егот р!аяпиЬ го 61агпепгогь Ьасгепорйа8е чесгога ° а я8п!Елсапг гедисг!оп 1п йе Егеъ)иепсу апд ехгепг оЕ де!ег!опа апд геаггап8етепь ш яп81езггапдед РХА ° гЬе аЪл16у го а!1оъч ае8тепга оЕ Р)ъ)А аечега! )г1!оЬааеа !и 1епВй го Ье ьо1асес1 Еп яп81е-ягапдед Еопп 1п адд)г!оп, Ь ь роаа!Ые го сопаггисг а сотр1еге ехргеааюп саааегге !п а рЬаВепгЫ, сопсашш8, Еог ехагпр!е, а аггоп8 ргогпогег, гЬе Вепе ог сР)ъ)А оЕ )пгегеаг, апд а ггапаспр6оп сегпигх паъог (е.8., р!еаае аее Кипари!! апд Со1плап 1993).
Ехргеаяоп рЬа8еппда оЕ ГЬь Суре сап Ье !ао1агес1 !п яике-аггапдед Р)ъ)А Еопп, ялЪ)есгед го яге-д!гесгед пипа8епеяя апд йеп ъьеь! го ггапаЕогт Е. сой ог уеааг Еог рЬепогурк ехргеаяоп. ! МРКОЧЕМЕ)ъ!Т5 1)ъ! РНАСЕМ!0$ А)ъ!О НЕ! РЕлх Ч1К13ЬЕБ ТЬе Вгаг Вепегагюп оЕ чессогя йе рЕМВВ чессогя даче рЬаВет!да а Ъад пате Ьесаиае, айег ялреппЕес6оп ъдй а Ье1рег ч)гиа, гЬе у!е1д оЕ яп81е-ягапдед РХА ъчаа Вепега1!у роог апд ъчаа !пйиепсед Ьу тапу Еасгогя )пс!исйп8 гЬе депягу оЕ гЬе си1гиге аг гЬе гппе оЕ лпЕесгюп, йе ти1- 6р!кпу оЕ шЕес6оп, апс1 гЬе 1еп8гЬ оЕ гппе аЕгег лпЕесгюп. Ьчеп ъчЬеп ялреппЕес6оп ъчаа сагпег1 оиг ипдег оргипа! сопсйгюпя йе уле!д оЕ рго8епу ч)гиа а11 гоо оЕгеп сопяагед ргедопппапг1у оЕ Ье1рег ч!гиаеа гайег гЬеп рас)са8ед а!п8!е-ягапдед рЬа8етЫ Р)ъ)А.
ТЬеае ргоЫета ъчеге агпе!югагед Ьу сопаггисг!п8 Ье! рег чггиаеа епсод!п8 а тигагед чегяоп оЕ Вепе 11 гЬаг ргеЕегеп6а1!у 3.44 Сйартег 3: )Ног)гтд иай Вастег!орйаде М)3 Сестогт асдчасеа (Ье РЬадетЫ опд|п оу гер1кацоп (р1еаае аее сЬе рапе! оп НЕСРЕК ВАСТЕК|ОРНАСЕ5), 1и адд|сюп, паче! асса|па оу Е. сой Ьане Ъееп епд!пеегед (е.д., Т)Н115, ТС2, апд МН1184) сЬас аге ейк|епс!у сгапауоппед Ьу р!аяпЫЬ ате еая1у шГессед Ьу сопцпоп1у иаед Ье1рег Ыгцьея апс1 у|е1д ргерагас|опа оу япд!е-асгапдед РЬадеи|Ы 33)ъ)А 1Ьас аге (гее сгогп сопсаиипадоп ичсЬ Ъассепа! 13)ъ)А апд Ье1рег РЬадеа (е.д., р!еаае аее (лп ес а!. 1992).
"!"Ье рагПси1аг а(таад оГ сЬе соте(дп Т))ъ)А йас Ы рас)садед шсо 1Ье ЪассепорЬаде рагск1еа дерепда оп (са опепсасюп ш 1Ье ро1у1ш1сег ясе оГ сЬе РЬадепсЫ нес(от апд оп 1Ье опепсабоп оу сЬе ЪассепорЬаде опд(п оу Т))ъ)А гер!кадоп сагпес1 |п сЬе чессог. Аа а сопаеъ)иепсе, таас согитегс!а1!у ача(!аЫе РЬадегпЫ нес(ага (е.д., РВ1иеасг|рс П (тот дстасадепе апд РСЕМУТ стоп| Рготеда) соте ш саит сЬ|га!!1(еа !и ъчЬ!сЬ сЬе опепсаПоп оу 1Ье ро1у!ш1сег аег)иепсе |а орроясе пс опе ра(г оГ чессогь (е.д., РВ!иеьспрс П ДК апд РВ1иеаспрс П КЯ), апг| сЬе опепсасюп оГ йе |псегдепк гед(оп Ы орроясе |и 1Ье ойег ра|г (е.д., РВ!иеаспрс П ВК (+) апд РВ1иеьспрс П ДК ! — ]).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
