Диссертация (1174350), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Для этого оценивалась экспрессия в зоне повреждения CD45 как маркераклеток костномозгового происхождения, CD34 – как маркера лейкоцитарныхклеток, ММР9 – матриксной металлопротеазы 9, актина и эндоглина.При изучении процесса репарации в области послеоперационного рубцау животныхконтрольнойгруппыустановлено,чтоужесначалафибробластической фазы воспаления фибробласты (на 3-и сутки) интенсивноэкспрессировали CD34+, к 7-м суткам только небольшое число клеток имелислабое специфическое окрашивание. Позднее специфическое окрашиваниезарегистрировать не удалось (Рисунки 29, 30).Аналогичный процесс зарегистрирован при локальном введении блокаторар38 МАРК (Рисунки 31, 32).59Рисунок 29 – Контрольная группа, 3-и сутки.
Интенсивная экспрессия CD34+маркеров клетками в зоне образования соединительной ткани.Иммуногистохимия, первичные антитела – CD34 (Santa cruz), 1:300,докрашивание гематоксилином60Рисунок 30 – Контрольная группа, 7-е сутки. Единичные фибробласты,экспрессирующие CD34+ в зоне образования соединительной ткани.Иммуногистохимия, первичные антитела – CD34 (Santa cruz), 1:300,докрашивание гематоксилином61Рисунок 31 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 3-и сутки.Интенсивная экспрессия CD34+ маркеров клетками в зоне образования рубца.Иммуногистохимия, первичные антитела – CD34, (Santa cruz),докрашивание гематоксилином62Рисунок 32 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Экспрессия CD34+ маркеров клетками в зоне образования соединительной ткани.Иммуногистохимия, первичные антитела – CD34 (Santa cruz),докрашивание гематоксилином63Рисунок 33 – Контрольная группа, 7-е сутки. CD34+CD45+ клеткив зоне образования послеоперационного рубца.
Иммунофлюоресценция,первичные антитела CD34 (Santa cruz), вторичные антитела, меченныеAlexa Fluor 488, первичные антитела CD45 (Santa cruz), вторичные антитела,меченные Alexa Fluor 568, докрашивание ядер DapiНаличие в зоне формирования послеоперационного рубца прогениторныхклеток фибробластического ряда, имеющих фенотип CD34+CD45+, у животныхконтрольной группы зарегистрировано только в срок 7 суток (Рисунок 33).В группесвведениемблокаторар38такоене зарегистрировано в течение всего срока наблюдения.сочетаниемаркеров64Рисунок 34 – Контрольная группа, 3-и сутки.
Миофибробластыв зоне формирования послеоперационного рубца.Иммуногистохимия, первичные антитела к актину (Epitomics),докрашивание гематоксилиномВыявление в зоне формирования рубца миофибробластов определялосьпо наличию положительной окраски на актин. Установлено, что как у животныхконтрольной группы, так и при введении блокатора р38 МАРК окрашивалосьтолько небольшое число клеток на 3-и и 7-е сутки раневого процесса (Рисунки 34–37).65Рисунок 35 – Контрольная группа, 7-е сутки.
Миофибробластыв зоне образования рубца. Иммуногистохимия, первичные антителак актину (Epitomics), докрашивание гематоксилином66Рисунок 36 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 3-и сутки.Единичные миофибробласты в зоне образования соединительной ткани.Иммуногистохимия, первичные антитела к актину (Epitomics),докрашивание гематоксилином67Рисунок 37 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Миофибробласты в зоне образования соединительной ткани.Иммуногистохимия, первичные антитела к актину (Epitomics),докрашивание гематоксилином68Рисунок 38 – Контрольная группа, 7-е сутки.
Единичные фиброкластыв зоне формирования послеоперационного рубца. Иммунофлюоресценция,первичные антитела к ММР9 (Epitomics), вторичные антитела,меченные Alexa Fluor 488Наличиевзонеформированиярубцафиброкластоввыявлялипо специфическому окрашиванию на ММР9 клеток фибробластического ряда.У животных контрольной группы такие клетки в зоне рубца обнаружены только на7-е сутки (Рисунок 38).69Рисунок 39 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 3-и сутки.Ярко светящиеся фиброкласты, экспрессирующие ММР9 в зоне образованияпослеоперационного рубца.
Иммунофлюоресценция, первичные антителак ММР9 (Epitomics), вторичные антитела, меченные Alexa Fluor 488,докрашивание ядер DapiВ группе с применением блокатора р38 клетки с такими маркерамификсировались на 3-и и 7-е сутки после моделирования послеоперационного рубцаихарактеризовались(Рисунок 39).высокойинтенсивностьюспецифическогосвечения70Рисунок 40 – Контрольная группа, 7-е сутки. Отсутствие окрашиванияна эндоглин в области послеоперационного рубца. Иммунофлюоресценция,первичные антитела к эндоглину (Santa cruz), вторичные антитела,меченные Alexa Fluor 488, докрашивание ядер DapiЭндоглин является мембранным гликопротеидом.
Применение блокаторар38 МАРК изменяло экспрессию эндоглина. Так, у животных контрольной группыклеткифибробластическогорядавне экспрессировали эндоглин (Рисунок 40).течениевсегосроканаблюдения71Рисунок 41 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Окрашивание на эндоглин в зоне послеоперационного рубца.Иммунофлюоресценция, первичные антитела к эндоглину (Santa cruz),вторичные антитела, меченные Alexa Fluor 488, докрашивание ядер DapiПри применении блокатора р38 отмечалась гиперэкспрессия фибробластамиэндоглина с 7-х по 30-е сутки (Рисунок 41). Как известно, гиперэкспрессияэндоглина тесно связана с перестройкой внеклеточного матрикса, изменениемморфологии фибробластов [90].Таким образом, локальное введение блокатора р38 МАРК снижаетпривлечениеформированияпрогениторныхклетокпослеоперационногофибробластическогорубца,повышаетрядавзонуфиброкластическуюактивность, приводит к гиперэкспрессии эндоглина на поверхности фибробластов,что косвенно свидетельствует об активной перестройке внеклеточного матрикса.723.5 Изучение ультраструктуры клеток фибробластического рядапри подавлении активности p38 МАР-киназыИзучение влияния блокатора р38 МАРК на состояние фибробластов в очагеобразования соединительной ткани показало, что у животных при примененииблокатора р38 резко снижается количество фибробластов в зоне формирующегосяпослеоперационного рубца, фибробласты располагаются одиночно.
При этомфибробласты не имеют морфологических признаков активации – ядрышкине выражены, слабо развита эндоплазматическая сеть (Рисунок 42).Рисунок 42 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Одиночно лежащий фибробласт в области ростамолодой соединительной ткани, отсутствие признаков активации,отсутствие ядрышка, слабо развитая эндоплазматическая сеть.Электронограмма. Ув. 690073Данная картина наблюдается весь период фибробластической фазывоспаления, начиная с 3-х суток. Отражением низкой плотности клеток в очагеобразования соединительной ткани и их невысокой функциональной активностиявляется низкая плотность формирующегося коллагена.
При этом коллагеновыеволокна рыхлые, неплотно упакованные, в отличие от контрольной группы,не образуют больших полей (Рисунки 43, 44).Рисунок 43 – Контрольная группа, 7-е сутки.Плотно упакованные волокна коллагена в области формирующегося рубца.Электронограмма.
Ув. 1450074Рисунок 44 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Рыхлые волокна коллагена в области формирующегося рубца.Электронограмма. Ув. 24000При электронно-микроскопическом исследовании нами отмечена деструкциямитохондрий, их отёк, набухание крист на 3-и и 7-е сутки после моделированияраневого процесса при искусственном подавлении активности р38 МАРК-каскада.При этом у животных контрольной группы митохондрии были сохранны(Рисунки 45, 46, 47).По-видимому, блокада каскада запускает апоптоз клеток-фибробластов,реализующийся через нарушение энергетического обмена внутри клетки. Данныйэффект нами описан впервые.75Рисунок 45 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 3-и сутки.Начальные признаки деструкции митохондрий в фибробласте.Электронограмма.
Ув. 1700076Рисунок 46 – Контрольная группа, 3-и сутки.Сохранные митохондрии в фибробласте.Электронограмма. Ув. 2400077Рисунок 47 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Фибробласт в области формирования рубца, набухание крист,деструкция митохондрий. Электронограмма. Ув. 6900Таким образом, изучение ультраструктуры фибробластов показалозначительное влияние ингибитора р38 МАРК на функциональную активностьклеток фибробластического ряда, что выражалось в снижении активностифибробластовизапускефибробластического ряда.митохондриальногоапоптозаклеток78ЗАКЛЮЧЕНИЕРубцы на коже возникают при глубоком повреждении дермы, котороевозникло в результате травмы или хирургического вмешательства.Травматическоеповреждениепочтинеизбежносопровождаетсяинфицированием и нередко потерей тканей с возникновением дефекта. В этихусловиях главной задачей для организма становится борьба с патогенноймикрофлорой и по возможности – скорейшее формирование нарушенного барьера,отделяющего его от внешней среды, с целью зашиты жизни.
Качествообразующегося при этом рубца отходит на второй план.Междутем,плановыехирургическиевмешательствавыполняютсяс соблюдением принципов асептики и антисептики и сопровождаются низкимуровнем инфицированности раны. Заживление хирургической раны протекаетв гораздо более благоприятных условиях, однако мы по-прежнему в малой степениконтролируем процесс формирования рубца и его качество.В практике пластического хирурга проблема образования рубцов имеетособое значение. Особенно после операций, выполненных по эстетическимпоказаниям, пациенты часто оценивают результат операции по качествупослеоперационного рубца на коже.
Некачественный рубец может стать большойпсихоэмоциональной проблемой для пациента и может служить основаниемдля судебных разбирательств.Лечение некачественного рубца в настоящее время представляет сложнуюзадачу, так как в нашем арсенале ещё нет средств, гарантировано оказывающихположительный эффект [21, 38, 53, 111, 135, 137, 144].Открытие митогенактивированных протеинкиназ позволяет по-новомуподойти к возможности управления процессом заживления послеоперационнойраны в пластической хирургии.Каскадные реакции фосфорилирования протеинкиназ, в результате которыхпроисходит передача полученного сигнала внутрь ядра клетки с последующей79активацией или, наоборот, подавлением активности соответствующих генов,возникают на самых ранних этапах после ранения.От того, какая информация попадёт в ядро клетки, во многом будет зависетьеё ответ на повреждение организма.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
