Диссертация (1174350), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Внутри клеток наблюдали крупные ядра с выраженнойскладчатостью мембраны ядра, с большим количеством крупных ядрышек,а в цитоплазме фибробластов была хорошо развита эндоплазматическая сетьс большим количеством рибосом. Локальное применение блокатора JNK MAPкиназы SP 600125 статистически значимо усиливало образование коллагенав зоне формирования рубца. Так на 3-и сутки раневого процесса количествоколлагена в 4 раза превышало соответствующий показатель в группе контроля.Статистически значимые различия в продукции коллагена сохранялись в течение241 месяца. В то же время использование блокатора JNK MAP-киназы SP 600125статистически значимо не влияло на относительный объём коллагена в интактнойкоже.Таким образом, к настоящему времени накоплены большие знания о леченииран, однако основная их часть имеет эмпирический или описательный характер.Лечение различных травм или ран, возникших как следствие заболеваний, привелок накоплению бесценного хирургического опыта.
Пластическая хирургияопределила правила нанесения разрезов и их зашивания, а также сформулировалапринципы замещения дефектов тканей. Однако приходится констатировать, чтопока мы только хотели бы добиться естественного неосложнённого хода событийинемечтаемусовершенствоватьприроду,чтобыиметьвозможностьформирования рубцов с заданными свойствами в заданные сроки или заживленияраны без образования рубца.Многочисленные экспериментальные исследования указывают на то,что МАР-киназные сигнальные каскады были сформированы в процессе эволюциии играют важную роль в таких биологических процессах, как воспаление ирегенерация.
Эти процессы теснейшим образом связаны с развитием иперестройкой соединительнотканных структур. Понимание роли MAPK-каскадовв этих процессах открывает возможность разработки способов воздействия на ростсоединительной ткани.К настоящему времени в доступной нам литературе отсутствуют сведенияо местном применении блокаторов р38 МАР-киназ в хирургической ранедля управления процессом заживления и образования рубца.25ГЛАВА 2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ2.1 Моделирование кожно-мышечной раныЭксперимент проведён на 63 самцах крыс линии Wistar, у которых изучалиместное действие блокатора р38 МАР-киназы на заживление кожно-мышечнойраны (Рисунок 1), нанесённой в асептических условиях, и последующееобразование рубца.
Вес животных составлял 220–250 г, а возраст – 9 месяцев.Исследования выполнены на базе ФГБНУ «Иркутский научный центр хирургиии травматологии» (директор – д.м.н., профессор В. А. Сороковиков). Работас экспериментальными животными (моделирование патологического процесса,наблюдение за животными, выведение из эксперимента) проводилась на базеотдела экспериментальной хирургии с виварием ФГБНУ «Иркутский научныйцентр хирургии и травматологии». Животные содержались в стандартных условияхвивария без ограничения доступа к воде и пище.Рисунок 1 – Модель кожно-мышечной раныСодержание и экспериментальные действия с животными осуществлялипо правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночныхживотных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986),и в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием26экспериментальных животных» (Приложение к Приказу Минздрава СССР от12.08.1977 г.
№ 755).Исследование было одобрено комитетом по этике ФГБНУ ИНЦХТ.Животные были разделены на две группы по 30 животных:1) контрольная – нанесение раны, внесение в рану лекарственной плёнки безактивного вещества [18];2) основная – изучение воздействия блокатора р38 МАР-киназы SB 203580(Tocris bioscience, кат. № 1202 Bath № 4 A/95665) (Рисунок 2) на заживление раны(нанесение раны, введение в рану блокатора р38 МАР-киназы в составелекарственной плёнки [18], наблюдение за заживлением раны), доза на одноживотное – 1,05 мкг (4,2 мкг/кг).Рисунок 2 – Блокатор р38 МАР-киназы SB 203580Расчёт дозы препарата на одно животное проводили на основании IC50 [69].Как известно, для блокатора р38 МАР-киназы SB 203580 IC50 составляет 50и 500 nM для p38 и p38β2 соответственно [165].В качестве контроля для оценки механических свойств неизменённой кожислужили исследования, выполненные на трёх интактных животных.Разработанная нами модель кожно-мышечной раны в клинических условияхнаиболее полно соответствует ране, возникающей при субпекторальномувеличении молочных желез через субмаммарную борозду.Перед началом операции в области спины крысы сбривали участок шерстии тщательно обрабатывали кожу раствором антисептика.
Далее крысе давалиобщийнаркозвнутрибрюшиннымвведениемсмесикетамина50 мг/кг,дроперидола 2,5 мг/кг и атропина 0,4 мг/кг.Оперировали в стерильных условиях операционной вивария. Одноразовымлезвием скальпеля № 15 крысам наносили рану по паравертебральной линии,27проникающую через кожу и подкожную клетчатку. Длина раны составляла 5 см.Затем рассекали собственную фасцию и в продольном направлении тупым путёмраздвигали мышечные волокна длинной мышцы спины для формированиявместилища под лекарственную плёнку. Тщательно останавливали кровотечение ипомещали в рану лекарственную плёнку с медленной резорбцией, содержащую дляосновной группы блокатор р38 МАРК SB203580, для контрольной группы – плёнкубез активного ингредиента [18].
Кожу и подкожную клетчатку зашивалиоднорядным узловым швом нитью пролен 4/0 (Ethicon) на атравматическойкруглой игле. Интервал между стежками составлял 1 см. Снятие швовосуществляли через 7 суток.В сроки 2, 6 и 12 часов и 1, 3 (по 3 животных в группе), 7, 14 и 30 суток(по 5 животных в группе) крыс выводили из эксперимента передозировкойраствора тиопентала натрия, введённого внутрибрюшинно.
Для исследованиязабирали ткани из области раны, фиксировали раствором FineFix (Milestone,Италия)для последующегогистологическогоииммуногистологическогоисследований. На нефиксированных фрагментах послеоперационного рубца на 7е, 14-е и 30-е сутки методом тензиометрии проводили определение механическиххарактеристик рубца аппаратом собственного изготовления.2.2 Определение механических характеристик сформированного рубцана модели кожно-мышечной раныСразу после выведения животного из эксперимента скальпелем вырезалиучасток ткани в области ранее нанесённой кожно-мышечной раны шириной 1 см,взятый перпендикулярно её плоскости, который включал в себя по 1 см тканис каждой стороны от формирующегося рубца, и исследовали его методомтензиометрии аппаратом собственного изготовления.Ткань фиксировали зажимами в тензиометре и к образцу ткани,прикладывали силу в направлении перпендикулярном плоскости раны.
Нагрузку28увеличивали дискретно, начиная с 50 грамм-сил с шагом 50 грамм-сил(от 0,4903 Н, шаг 0,4903 Н), и доводили до достижения разрыва образца.В области пластической деформации скорость нарастания нагрузкидо достижения разрыва составляла 5 гс/с.Измеряли удлинение в ответ на прилагаемую нагрузку. Вычислялиотносительное удлинение как отношение длины при приложении силы к начальнойдлинеобразца.перпендикулярномОпределялилиниипределраны,прочноститочкуобразцапереходавнаправлении,упругойдеформациив пластическую деформацию, а также рассчитывали модуль упругости Юнга.Для каждого образца стоили свой график.После определения значения силы, вызывающей разрыв образца, вычислялизначение разрушающей нагрузки как отношение приложенной разрушающей силык площади поперечного сечения образца по формуле:Разрушающая нагрузка = F / S, где: F – сила в Ньютонах; S – площадьпоперечного сечения, перпендикулярного направлению действия силы.В зоне упругой деформации рассчитывали модуль упругости Юнга –коэффициент, характеризующий сопротивление материала растяжению/сжатиюпри упругой деформации:E = F / S × L / ∆L, где: E – собственно модуль упругости, измеряемый вПаскалях; F – сила в Ньютонах; S – площадь сечения; L – длина деформируемогообразца; ∆L – модуль изменения длины образца в результате упругой деформации.Сравнение показателей проводилось между группами, а также по отношениюк поведению на нагрузку интактной кожи.Исследование проведено в сроки 7, 14 и 30 суток после операции, а такжеу интактных животных.
От каждого животного исследовали по 3 образца.2.3 Морфологические и морфометрические исследованияФиксациюповрежденияиссечённыхпроводиливфрагментовраствореизFineFixзоныпослеоперационного(Milestone,Италия).Затем29осуществляли стандартную гистологическую проводку и заливку в парафиновыеблоки, на микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 3 мкм.Препараты окрашивали гематоксилин-эозином, по методу Ван Гизона(на выявление коллагеновых волокон) [10, 54]. Исследование проводили методомсветовой микроскопии с использованием микроскопа Nikon 80i (Япония).Размерная метка представлена на каждой микрофотографии.Проводили морфометрические исследования с использованием программыImageJ (Национальный институт здоровья, США).В каждом образце фотографировали при увеличении 400× по 10 зонв области рубца, в зоне, прилегающей к зоне рубца, и в интактной дерме.Для оценки формирования грубоволокнистой соединительной тканина микрофотографиях при использовании окраски по методу Ван Гизона,определялисоотношение площади, занимаемойокрашеннымиволокнамиколлагена, к общей площади ткани на срезе [32]:Sотн S колл 100%S тк,где: Sотн – относительная площадь коллагена на срезе; Sколл – площадь, занимаемаяколлагеновымиволокнами;Sтк–площадьисследуемойтканина микропрепарате.2.4 Иммуногистохимические и иммунофлюоресцентныеисследованияДля проведения иммуноморфологических исследований срезы толщиной5 мкм монтировали на предметные стёкла с адгезивным покрытием (поли-L-лизин)(ThermoScientific-Menzel,Германия).Препаратыдепарафинировалипоследовательно в толуоле в течение 5 минут, затем в этиловом спиртепонижающейся концентрации – 100°, 96°, 90°, 70° – по 1 минуте, после чегопомещали в дистиллированную воду на 10 минут.30Демаскирование антигенов проводили в цитратном буфере при pH = 6,0в микроволновой печи мощностью 800 Вт в течение 20 минут.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
