Диссертация (1174350), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Образцына препаратах обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002).Для иммуногистохимического исследования проводили блокированиеэндогенной пероксидазы нанесением 3%-го Н2О2 в течение 5 минут, тщательноотмывали Трис-буфером (рН = 7,6).Неспецифическое связывание с антигенными эпитопами блокировалинанесением 0,4%-го раствора казеина в течение 5 минут, отмывали Трис-буфером(рН = 7,6).Затем на образцы наносили первичные антитела в рабочем разведении:1) Actin monoclonal antibody (Rabbit) (Epitomics, Cat. № 1844-1, Lot D 091805),1:200;2) CD34 (ICO 115) monoclonal IgG (Mouse) (Santa Cruz, Cat. N Sc-7324, LotCO909), 1:300.Инкубацию препаратов проводили во влажной камере при комнатнойтемпературе в течение 1 часа, тщательно отмывали Трис-буфером (рН = 7,6), послечего препараты инкубировали с вторичными антителами Novolink Polymer(Novocastra, Lot 711236), меченными пероксидазой в течение 30 минут, отмывалиТрис-буфером (рН = 7,6).На срезы наносили субстратную смесь, содержащую 3'3'-диаминобензидин в0,05%-м Н2О2 (Novocastra, Lot 710550), на 5 минут, отмывали водой.
Докрашиваниеядер клеток проводили гематоксилином. Затем срезы дегидратировали в спиртахвозрастающей концентрации и толуоле, заключали в среду Permanent SlideMounting Medium (Novocastra, Lot 713708), подвергали световой микроскопии.При проведении иммунофлюоресцентного исследования для усилениясигнала на препараты после демаскирования наносили Image-iT FX signal enhancer(Invitrogen. Cat. N I 36933, Lot 681688), инкубировали в течение 30 минут.Отмывали фосфатно-солевым буфером (рН = 7,6).31Для блокады неспецифического окрашивания наносили раствор сывороткикозы (нормальной) (Invitrogen, Lot 757418A), инкубировали при комнатнойтемпературе в течение 30 минут.Затем на срезы помещали первичные антитела в рабочем разведении,инкубировали в течение 1 часа:1) CD34 (ICO 115) monoclonal IgG (Mouse) (Santa Cruz, Cat. N Sc-7324,Lot C 0909), рабочее разведение 1:300;2) ММР9 monoclonal antibody IgG (Rabbit) (Epitomics, Cat.
N 2551-1,Lot YG 113001P), рабочее разведение 1:200;3) антитела к CD45 (ОХ 30) monoclonal IgG (Mouse) (Santa Cruz, Cat. N Sc53047, Lot В 2409), рабочее разведение 1:300;4) антитела к Endoglin (M-20) goat polyclonal IgG (Santa Cruz, Cat. N Sc19793, Lot I 0908), рабочее разведение 1:300.После промывки Трис-буфером (рН = 7,6) наносили вторичные антителана 30 минут:1) Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11029,Lot 898236), рабочее разведение 1:300;2) Alexa fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N 11034,Lot 870976), рабочее разведение 1:300;3) Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11031,Lot 822389), рабочее разведение 1:300;4) Alexa fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) (Invitrogen, Cat.
N A-1105Lot 870969), рабочее разведение 1:300.Проводили процедуры как одинарного, так и двойного мечения.Промывали Трис-буфером (рН = 7,6), ядра докрашивали Dapi (Biotium,Cat. N 40011, Lot 8D 0605).Для визуализации специфической окраски и фотографирования образцовиспользовали микроскоп Nikon Eclipse 80i с камерой Nikon DS-Fi1c с приставкойдля эпифлюоресценции (Япония) и фильтрами Nikon DAPI, Nikon B-2A,Nikon TRITC. Размерная метка представлена на каждой микрофотографии.322.5 Электронно-микроскопические исследованияОбразцы ткани из области послеоперационного рубца, взятые на 3-и и 7-есутки, фиксировали в 2,5%-м глутаровом альдегиде на 0,1 М какодилатном буфере(рН = 7,4) в течение 2 часов. Тщательно отмывали 0,1 М какодилатным буфером(рН = 7,4), проводили дофиксацию образцов в 1%-м растворе черырёхокиси осмия,обезвоживаливспиртахвозрастающейконцентрации,пропиленоксиде,пропитывали и заливали в Embed 812 (Electron Microscopy Sciences, США) [23].На ультратоме «LKB» (LKB, BROMMA, Швеция) изготавливали ультратонкиесрезы, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца.
Образцы исследовалина электронном микроскопе «TEM-410» (Голландия).Морфологические, иммуноморфологические, электронно-микроскопическиеисследованияпроведенынабазелабораторииклеточныхтехнологийи регенеративной медицины ФГБНУ «Иркутский научный центр хирургиии травматологии»(заведующаялабораторией–д.м.н.,профессорРАНИ. А. Шурыгина).2.6 Методы статистического анализаНормальность распределения количественных показателей определяласьпо критерию W Шапиро – Уилка (Shapiro – Wilk’s test). Дисперсионный анализ(ANOVA) проводился с проверкой гипотезы о равенстве дисперсий совокупностивыборок при помощи модификации Levene's test.
Для оценки значимости различийв попарно сравниваемых группах использовали критерий Манна – Уитни; приоценке механических свойств использовался метод множественных сравненийШеффе [11]. При проведении всех видов статистического анализа критическийуровень значимости критериев принимался равным 0,05.
Данные представлены ввиде: среднее ± ошибка среднего (M ± SE) – при нормальном распределении;медиана [25% квартиль – 75% квартиль] (Me [Q25–Q75]) – при несоответствиираспределения критериям нормальности.33ГЛАВА 3РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1 Особенности формирования послеоперационного рубцав условиях локального подавления активности p38 МАР-киназыпри заживлении кожно-мышечной раныНамиизученыпри снижениизакономерностиактивностиинтраоперационноговведениязаживленияр38 MAPKблокаторавхирургическойусловияхр38 SB 203580раныоднократноговсоставелекарственной плёнки с медленным высвобождением действующего веществав зону репарации.При исследовании процесса заживления раны у контрольной группы(введение лекарственной плёнки без активного действующего вещества)установлено, что репаративный процесс соответствовал канонам формированияпослеоперационного рубца в условиях асептической раны.34Рисунок 3 – Контрольная группа, 2 часа.Нейтрофильная инфильтрация в зоне повреждения.Окраска гематоксилин-эозиномТак, через 2 часа после моделирования раны отмечался отёк подкожнойклетчатки, дермы, начиналась нейтрофильная инфильтрация в зоне раны(Рисунок 3).35Рисунок 4 – Контрольная группа, 1-е сутки.Обширная зона нейтрофильной инфильтрации в области раны.Окраска гематоксилин-эозиномПриисследованиичерез6,12часови1 сутки(Рисунок 4)после повреждения сохранялись отёк и нейтрофильная инфильтрация, при этоммаксимальная выраженность нейтрофильной инфильтрации приходилась на срок12 часов.36Рисунок 5 – Контрольная группа, 7-е сутки.Соединительная ткань в области раны.Окраска гематоксилин-эозиномС 3-х суток после моделирования раны у животных контрольной группыначиналась фибробластическая фаза воспаления – отмечалось формированиемолодой грануляционной ткани, плотность фибробластов нарастала к 7-мсуткам после моделирования (Рисунок 5).37Рисунок 6 – Контрольная группа, 30-е сутки.Выраженный рубец в области раны.Окраска гематоксилин-эозиномВ дальнейшем при морфологическом исследовании регистрировалосьсозревание соединительной ткани, и к концу наблюдения (30-м суткам) на местераны формировался хорошо выраженный рубец, при этом плотностьфибробластов в области раны снижалась (Рисунок 6).38Рисунок 7 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 2 часа.Отсутствие нейтрофильной инфильтрации, умеренный отёк в области раны.Окраска гематоксилин-эозиномУ животных, которым вводился блокатор р38, через 2 часа после нанесениятравмы наблюдался умеренный отёк подкожной клетчатки в области раны,нейтрофильной инфильтрации не отмечено (Рисунок 7).39Рисунок 8 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 1-е сутки.Слабовыраженная нейтрофильная инфильтрация,маленькая площадь инфильтрации в области раны.Окраска гематоксилин-эозиномЧерез 6 часов отмечены умеренная нейтрофильная инфильтрация и отёкобласти раны.
Через 12 часов сохранялись умеренная инфильтрация зоныповреждения нейтрофилами и отёк. К 1-м суткам эксперимента выраженностьнейтрофильной инфильтрации достигала максимума, однако она была значительноменее выраженной как по площади зоны инфильтрации, так и по плотностиклеточных элементов, по сравнению с группой контроля (Рисунок 8).40Рисунок 9 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 7-е сутки.Низкая плотность клеток фибробластического рядав области формирующегося рубца.Окраска гематоксилин-эозиномК 3-м суткам наступала фибробластическая фаза воспаления с началомформирования молодой грануляционной ткани. Однако и на 7-е сутки развитиесоединительной ткани в области раны отставало от уровня группы контроля, зонаформирования соединительной ткани оставалась очень узкой, с низкой плотностьюклеточных элементов (Рисунок 9).41Рисунок 10 – Группа с блокадой р38 МАР-киназного каскада, 30-е сутки.Очень узкий соединительнотканный рубец на месте раны.Окраска гематоксилин-эозиномК 14-м суткам формировался узкий аккуратный рубец в области раны,наблюдалась полная эпителизация раны.
К 30-м суткам на месте раны наблюдалсязрелый очень узкий соединительнотканный рубец, малозаметный на коже(Рисунок 10).Распределение ширины рубца в контрольной группе и в группе с введениемблокатора р38 на 30-е сутки представлено на рисунках 10 и 11.42Group=ControlHistogram: Width_micrometersK-S d = 0,24057, p < 0,10 ; Lilliefors p < 0,01Expected Normal98No. of obs.765432100200400600800100012001400X <= Category BoundaryРисунок 11 – Гистограмма распределения ширины рубца в областикожной раны на 30-е сутки у животных контрольной группыGroup=p38Histogram: Width_micrometersK-S d = 0,12940, p > 0.20; Lilliefors p < 0,20Expected Normal1614No.
of obs.121086420050100150200250300350400X <= Category BoundaryРисунок 12 – Гистограмма распределения ширины рубца в областикожной раны на 30-е сутки у животных, получавших блокатор р3843У животных основной группы на 30-е сутки ширина сформированного рубцасоставляла 157,8 [120,11–206,45] мкм, в то время как у животных контрольнойгруппы – 763,47 [334,1–1285,31] мкм.
Различия статистически значимы –по критерию Манна – Уитни Z = 6,073, p = 0,00001 (Рисунок 13, Таблица 1).Рисунок 13 – Ширина рубца в области кожной раны на 30-е сутки у животныхконтрольной группы и животных, получавших блокатор р38Таблица 1 – Различия по U-критерию Манна – Уитни в ширине рубца междуконтрольной группой и группой с введением блокатора р38ПараметрRankSum – ControlRankSum – p38UZp-levelШирина рубца, мкм989,0000607,000012,000006,0731070,00001Таким образом, блокада р38 МАР-киназного каскада в ранние срокизаживления хирургической раны в значительной степени изменяет воспалительныйпроцесс, влияя на его различные фазы. При этом снижается выраженностьнейтрофильной инфильтрации, подавляется выраженность фибробластической44фазы воспаления, что в итоге приводит к формированию статистически значимоболее узкого послеоперационного рубца по сравнению с группой контроля.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
