Диссертация (1174284), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Распределение по генотипам HCV следующее: 1генотип обнаружен у 71 (58,3%) ребенка, генотип 2 - у 7 (5,7%), генотип 3 – у 42(34,4%), межгенотипная рекомбинантная форма RF_2k/1b обнаружена у 2 (1,6%)детей. Во II группу включен 51 ребенок с ХГС , получавший монотерапию ИФНα2а для подкожного введения (Роферон-А, Хоффманн Ля-Рош, Швейцария) в дозе3 млн МЕ 3 раза в неделю на протяжении 48 недель вне зависимости от генотипаHCV .
Распределение по генотипам HCV во II группе: генотип 1 – у 25 (49%),генотип 2- у 2 (3,9%) и генотип 3 выявлен у 24 (47,1%) обследованных детей.29Критерии включения:1. Диагностированный хронический вирусный гепатит С, уровень вируснойнагрузки в крови - не ниже 10^4 МЕ/мл;2. Возраст от 3 до 17 лет;3. Наличие информированного согласия пациентов и/или их законныхпредставителей.Критерии исключения:1. Аутоиммунные заболевания (аутоиммунный гепатит, тиреоидит и т.д.);2. Наличие судорожного синдрома, психоза (в анамнезе или в настоящеевремя);3.
Выраженная нейтро- и/или тромбоцитопения;4. Обменные и наследственные заболевания;5. Хронические соматические заболевания в стадии декомпенсации;6. Возраст детей младше 3-х лет.Все дети, вошедшие в исследование эффективности и безопасности ПВТ,имели показания и не имели противопоказаний к проведению ПВТ. До стартатерапии проводилось лабораторно-инструментальное обследование (клиническийанализ крови, биохимический анализ крови, ПЦР РНК HCV, тиреоидный профиль,ЭКГ, непрямая эластография печени). Контроль эффективности и безопасностиПВТ проводился на 4, 12, 24, 36 и 48 неделях терапии и с 24 по 48 неделю поокончании лечения.ЭффективностьПВТоценивалисьпоследующимпоказателям:нормализация печеночных трансаминаз и достижение УВО спустя 24 недели послеокончания ПВТ [74,81,91].
Ответ на ПВТ оценивался по следующим критериям [32,56, 95,99,144]:• быстрый вирусологический ответ (БВО) – элиминация вируса на 4неделе лечения;30ранний вирусологический ответ (РВО) – элиминация HCV на 12•неделе терапии;• медленный вирусологический ответ – снижение вирусной нагрузкиболее, чем на 2 log МЕ/мл от исходного уровня на 12 неделе,элиминация вируса к 24 неделе лечения и до конца терапии;• первичная вирусологическая ремиссия - отсутствие РНК HCV всыворотке крови в ходе лечения и на момент окончания ПВТ;• устойчивый вирусологический ответ (УВО) - отсутствие РНК HCV всыворотке крови спустя 24 недели после завершения ПВТ.Неэффективность ПВТ оценивалась по следующим показателям [32, 56,95,99,144]:• вирусологический прорыв – повторное появление РНК HCV во времятерапии;•рецидив – повторное появление РНК HCV после прекращениятерапии;• отсутствие ответа на ПВТ – снижение РНК HCV менее, чем на 2 log10к 12 неделе лечения.Безопасность лечения оценивали на основании мониторинга клинических илабораторных НЯ.
Степень тяжести НЯ оценивалась в соответствии с ОбщимитерминологическимикритерияминежелательныхявленийНациональногоинститута рака (NCI CTCAE, версия 4) [14]. Отмена терапии проводилась привыраженности НЯ III степени.До старта ПВТ у 19 детей с ХГС I группы был диагностирован дефицит МТразличной степени тяжести. Этим детям была назначена специализированнаяизокалорийная (100 мл смеси=100 ккал) лечебная смесь на основе белка коровьегомолока, которая используется для кормления детей старше 1 года жизни. Детиполучали смесь в течение всего периода лечения в объеме 250 мл в сутки.312.3 Клинические методы исследованияВсем детям с ХГС, учитывая отсутствие желтушной формы дебютазаболевания, проводился сбор эпидемиологического анамнеза для определенияпредполагаемогопутиивозраста инфицированияХГС;оценкажалоб,предъявляемых пациентами и/или их родителями.
При осмотре проводиласьоценка окраски кожи и слизистых, наличие гепатомегалии и спленомегалии,выраженность внепеченочных проявлений (наличие пальмарной эритемы,сосудистых звездочек, васкулитов, расширения венозной сети). Всем детям доначала ПВТ, по окончании и через 24 и 48 недель после лечения определялисьантропометрические данные (масса тела, рост), Z-score роста и Z-score ИМТ спомощью компьютерных программ Anthro (у детей младше 5 лет) и Anthro Plus(старше 5 лет) [143].
В соответствии с диагностическими критериями ВОЗнормальная масса тела (МТ) соответствует Z-score ИМТ от -0,99 до +0,99, приизбыточной МТ значение индекса от +1 до +1,99, при ожирении ≥ +2, дефицит МТлегкой степени - Z-score ИМТ ≤ -1, средней степени - Z-score ИМТ < -1,99 -2,99,тяжелой степени - Z-score ИМТ < -3. Нормальный рост устанавливается при Z-scoreроста от - 1,99 +1,99, высокорослость диагностируется при Z-score роста ≥ +2,низкорослость ≤ -2.2.4 Лабораторные методы исследованияВсе лабораторные методы исследования выполнялись в лабораторииотделения клинической биохимии, иммунологии и аллергологии (зав. отделениемк.м.н. Короткова Т.Н.).С целью исключения иных невирусных болезней печени у всех пациентовбыли определены уровни церулоплазмина, альфа-1-антитрипсина, ферритина,сывороточного железа, антинуклеарных антител, антинейтрофильных антител.32Сводный перечень лабораторных исследований, выполненных у детей сХГС приведен в таблице 2.Таблица 2 - Протокол обследования детей на фоне ПВТВсем детям в установленные протоколом сроки было выполнено клиническоеисследование периферической крови, биохимический анализ крови с помощьютест-системы фирмы «Vital Development Corporation» (Россия) на анализаторе«KONELAB Prime 60i» («Thermo Scientific», Финляндия).33Содержание растворимой фракции активированных Т-хелперов (sCD134),провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1α, IL-6 и интерферон-γ индуцибельногобелка (IP-10) определяли методом иммуноферментного анализа с использованиемнаборовфирмы«BCMDiagnostics»,«BenderMedsystems»(США)наспектрофотометре «Tecan» (Австрия).
Учитывая высокий риск развитияосложнений ХГС в виде гепатоцеллюлярной карциномы и цирроза печени, всемдетям определялся уровень альфафетопротеина (АФП) с помощью твердофазногометода иммунноанализа (ELISA).ПриустановлениидиагнозавирусногогепатитаCиспользоваликлассификацию вирусных гепатитов, принятой в 1994 году в Лос-Анджелесе(США) [52]. В данной классификации, учитывается активность процесса поданным аминотрансфераз (минимальная 1,5–2 нормы; низкая 2–5 норм; умеренная5–10 норм; выраженная (выше 10 норм) и степень фиброзирования, а такженаличие репликативной активности вируса.2.5 Молекулярно-генетические методы исследованияС целью проведения молекулярно-генетического анализа у больных с ХГСнатощак собирали 2-3 мл венозной крови в вакуумные пробирки с 0,05М растворомЭДТА.
Методом ПЦР определяли наличие РНК HCV (количественное содержаниеи генотипирование) абсолютно всем детям.Вирусную нагрузку определяли с помощью коммерческой тест-системы«ОТ-гепатоген-С-количественный»(«ДНК-технология»,Россия)счувствительностью 15 МЕ\мл. Анализ состоял из следующих этапов: выделениеРНК (пробоподготовка), реакция обратной транскрипции, ПЦР амплификациякДНК HCV в режиме реального времени. На стадии выделения РНК в реакционнуюсмесь добавляют внутренний контрольный образец, предназначенный для оценкиэффективности всех этапов исследования. ДНК-зонды, использующиеся длядетекции продуктов амплификации искомой ДНК и внутренних контрольных34образцов, помечены флуоресцентными метками FAM и HEX, что позволяетраздельно регистрировать результаты амплификации искомой ДНК и внутреннихконтрольных образцов.Генотипирование HCV выполняли методом ОТ-ПЦР с системой генотипспецифических праймеров, позволяющих идентифицировать субтипы 1а, 1b, 2a, 2b,3a, 3b.
На первом этапе с помощью специальных праймеров получали ампликон,содержащий область core с последовательностью с 1-го по 400-ый нуклеотидныйостаток. На втором этапе ПЦР проводили с двумя наборами генотипспецифических праймеров на определение соответствующих субтипов вируса.Генотип и субтип вируса устанавливали по длине визуализируемого продукта вагарозном геле.
Для этого проводили несколько ПЦР.Анализ полиморфных маркеров генетических полиморфизмов rs12979860С>Т и rs8099917 Т>G гена IFNL3 и уровня цитокинов проведен 80 детям с ХГС.Детекцию полиморфизма гена IFNL3 в локусах rs12979860 (С>T) и rs8099917(T>G) проводили методом ПЦР в режиме «реального времени» на детектирующемамплификаторе ДТ-96 фирмы ДНК-технология. После денатурации (80°С, 2 мин;94°С, 5 мин) проводили амплификацию из 51 цикла, каждый из которых включал:денатурацию (94°С, 30 сек), отжиг праймеров и элонгацию (67°С, 10 сек) – 5циклов; денатурацию (94°С, 5сек), отжиг праймеров и элонгацию (67°С, 5 сек) – 45циклов; один цикл при 25°С, 30 сек.
Автоматическая детекция результатовамплификации производилась прибором ДТ-96. ПЦР проводили в объеме 35 мкл врастворе следующего состава: 20 мкл раствора праймеров, 10 мкл смеси Taqполимеразы и буфера, а также 5 мкл ДНК. Экспоненциальный рост количествапродукта в канале FAM, и его отсутствие в канале HEX детектируется, как генотипCC; рост в обоих каналах детектируется, как CT и только в канале HEX – как TT.Экспоненциальный рост количества продукта в канале FAM, и его отсутствие вканале HEX детектируется, как генотип ТТ; рост в обоих каналах детектируется,как TG и только в канале HEX – как GG.
Определение полиморфизмов IFNL3 в35локусах rs12979860 (С>T) и rs8099917 (T>G) проведено дополнительно у 25 детей,неинфицированных HCV с целью контроля.2.6 Инструментальные методы исследованияУльтразвуковое исследование. Всем пациентам в динамике былопроведено ультразвуковое обследование органов брюшной полости на аппарате«LOGIQS6»к.м.н.ДворяковскойГ.М.вотделениипедиатрическойгастроэнтерологии, гепатологии и диетологии ФГБУН «ФИЦ питания ибиотехнологии». При ультразвуковом исследовании оценивались следующиепараметры: эхоструктура печени, ее размеры, контур, характер сосудистогорисунка,состояниежелчевыводящейсистемы,размерыиструктураподжелудочной железы, селезенки, диаметр крупных сосудов- портальной иселезеночной вен.Определение степени фиброза печени выполнено на аппарате FibroScan,(«Echosense», Франция) методом непрямой эластометрии (табл.
3).Таблица 3 – Частота выявления фиброза печени по данным непрямой эластометриипечени у детей с ХГССтадия фиброза поMETAVIRI группа, n (%)II группа, n (%)F0F1F2F3F492 (75,4%)22 (18,0%)4 (3,3%)3 (2,5%)1 (0,8%)40 (78,4%)5 (9,8%)4 (7,8%)1 (2,0%)1 (2,0%)Определение состава тела. Показатели состава тела (содержание жировой,мышечной массы, подкожно-жировой клетчатки, протеинов, минеральныхвеществ, общей воды организма) оценивали методом биоимпедансометрии с36использованием мультичастотного анализатора «InBody 360» (Biospace, южнаяКорея). Биоимпедансометрия позволяет по электрическому сопротивлениюоценить количественно разные компоненты состава тела. На основе измеренногозначения активного сопротивления определяется количество общей жидкостиорганизма и тощей массы тела. Жировая масса вычисляется как разность значениймассы тела и тощей массы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
