Диссертация (1174185), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Высокое разрешение для точныхи воспроизводимых результатовМетод TGGE1. Не требует денатурирующихТочная природаагентовнуклеотидного2. Большая воспроизводимостьизменения3. Анализировать фрагментынеизвестнас размером до 1 000 п. н.Метод HPLC1. Высокая точность1. Высокая2. Возможность определениястоимость колонокмалых количеств веществ2. Точная природа3. Высокая эффективностьнуклеотидногоразделенияизменения4. Гибкость изменения условийне известнаразделения3. Необходимо5. Экспрессность анализасеквенирование2446. Сравнительная простотадля определенияаппаратурного оформленияприроды мутации7. Возможность автоматизации4.
Трудноиндентифицировать гетерозиготыМетод1. Прост в примененииКачественныйопределения2. Наличие специализированныхметод.гетероплазмиинаборов для сканированияс исполь-мутацийзованиемSurveyornucleaseМетод плюс-1. Использование1. Использованиеминусдидезоксинуклеотидоврадиоактивнойсеквениро-с флуоресцентными меткамиметкивания пос разными длинами волн2. СложностьСенгеруиспускания позволяет проводитьразделенияреакциюфрагментовв одной пробирке.в электрофорезе2.
Секвенаторы такого типа могут3. Усложнениепроанализировать за один разза счетпоследовательности длиной 500— использования1000 нуклеотидов.фага4. Потеряточности припрочтениибольшихфрагментов245Метод1. Достоверный метод1. РезультатыSNaPshotидентификации неотносительныохарактеризованных2. Малая точностьнуклеотидных нарушений,данныхпозволяющий впоследствии3. Требуетсяопределить несвоевременныенормированиестоп-кодоны, миссенс- илирезультатовмолчащие мутации2. Можно использовать для SNPанализа3. Возможность автоматизацииСледует подчеркнуть, что наибольший смысл имеет изучение тех мутациймитохондриального генома, которые могут приводитьк фенотипическимизменениям у человека.
К таким изменениям можно отнести проявленияразличных заболеваний, в том числе полигенных мультифакториальныхпатологий, к которым относится атеросклероз (таблица 80) [89].С помощью разработанного автором с коллегами метода количественнойоценки мутантного аллеля митохондриального генома были обнаружены триновые мутации - m.652delG, m.961delC и m.5132insAA, ранее не описанные влитературе [89, 495]. Две из них принадлежат гену 12 субъединицырибосомальной РНК, а последняя – гену субъединицы 2 NADH дегидрогеназы[89, 495].Автором впервые было установлено, что нормальные и пораженныеатеросклерозом участки сосудистой стенки могут иметь отличия по уровнюгетероплазмии ряда мутаций [89, 114]. Из 42 исследованных мутаций сорококазались гетероплазмичными (m.652delG, m.716T>G, m.750A>G,m.961delC,m.1555A>G, m.3256C>T, m.3258T>C, m.3271T>C, m.3280A>G, m.3285C>T,m.3316G>A, m.3336T>C, m.5132insAA, m.5178C>A, m.5540G>A, m.5692T>C,m.5814T>C, m.6489C>A, m.8993T>G, m.8993T>C, m.9379G>A, m.9480del15,246m.9537delC,m.14482C>G,m.12315G>A,m.13513G>A,m.14459G>A,m.14482C>A,m.14487T>C,m.14709T>C,m.14846G>A,m.14484T>C,m.15059G>A, m.652insG, m.961insC, m.15084G>A, m.5132delAA, m.15498del24,m.15452C>A,m.15762G>A,адве(m.8362T>Gиm.8363G>A)–гомоплазмичными по отсутствию мутантного аллеля приатеросклерозе [89,114].В настоящем исследовании выявлено, что преобладающими мутациями вбольшинствеатеросклеротическихпораженийявляютсяm.652delG,m.1555A>G, m.3256C>T, m.3336T>C, m.5178C>A, m.12315G>A, m.13513G>A,m.14459G>A, m.652insG, m.14846G>A и m.15059G>A [13, 27, 45, 83, 87-98, 100102, 104-116, 119, 120, 160, 463, 482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532].
Однииз них ассоциированы с атеросклерозом, другие – связаны с отсутствиематеросклеротических поражений у индивидов [13, 27, 45, 83, 87-98, 100-102,104-116, 119, 120, 160, 463, 482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532]. Согласнолитературным источникам, данные мутациисвязаны с определеннымизаболеваниями (таблица 80). Следует подчеркнуть, что в нашем исследованиивыявлена ассоциация ранее нигде не описанной мутации m.652delG сатеросклерозом [89, 114].Таблица 80. Данные о патологиях, вызываемых исследованнымимутациями [89, 141, 183, 198, 207, 252, 269, 287, 289, 290, 294, 330, 369, 402,424, 481]ГенМутацияПатологияMT-RNR1m.652insGМитохондриальные миопатииm.1555A>GТугоухость, индуцированнаяаминогликозидами ибеспричинная потеря слуха,чувствительность каминогликозидным247антибиотикам; глухотаMT-TL1m.3256C>TMELAS, энцефалопатия,лактоцидоз, миопатия,кардиомиопатия,интсультоподобный удар вправом париетоокципитальномрайоне головного мозга,окислительный дефектмышечного метаболизмаMT-ND1m.3336Т>С,Сахарный диабет типа 2молчащая мутация, прикоторой аминокислота впервой белковойсубъединице ферментаNADH-дегидрогеназыостается прежнейMT-ND2m.5178C>A (вызываетОстрый инфаркт миокарда,замену лейцина насахарный диабет типа 2метионин)MT-TL2m.12315G>AПигментная ретинопатия,блефароптоз, офтальмоплегияи глухота248MT-ND5m.13513G>AСиндром Ли (наследственнаяэнцефаломиопатия); синдромВольффа - Паркинсона –Уайта(синдром преждевременноговозбуждения желудочков) икардиомиопатияMT-ND6m.14459G>AНаследственная невропатия(изменение аланина наглаза, синдром Лебера.валин в 72-ойАссоциирована с дисфункциейаминокислотнойбазальных ганглиев,позиции, котораямышечной спастичностью инаходится в наиболееэнцефалопатиейконсервативном районебелка ND6)MT-CYTBm.14846G>AМитохондриальная миопатия(аминокислотная заменаGlySer в позициибелковой цепи 34.Может привести кдисфункции фермента).m.15059G>AМитохондриальная миопатия(происходит заменаглицина на стоп-кодон впозиции пептида 190.Трансляция белка нарибосомеостанавливается.
Врезультате белококазывается короче на249244 аминокислоты.Может привести кдисфункции фермента).Отметим, что делеция гуанина в позиции 652 митохондриального геномаприводит к дефекту малой субъединицы (12S) рибосомальной РНК. С большойвероятностью, функция мутантных рибосом становится угнетенной либопроисходит их полная дисфункция [83, 87, 89, 93, 94, 96, 98, 99, 102-104, 108,109, 111-115, 124, 125, 446, 463, 493-496, 500, 502, 504-506, 530].
Вмитохондриях уменьшается экспрессия белковых субъединиц ферментовдыхательной цепи, следствием которой является уменьшение количестваданных ферментов. Конечным итогом данного патогенетического процессаможет быть возникновение и развитие атеросклеротических поражений [83, 87,89, 93, 94, 96, 98, 99, 102-104, 108, 109, 111-115, 124, 125, 446, 463, 493-496, 500,502, 504-506, 530].В то же время инсерция гуанина в позиции 652 митохондриальногогенома, по всей видимости, стабилизирует субъединицу 12S рибосомальнойРНК и, следовательно, рибосому [83, 87, 89, 93-95, 97-99, 102-104, 108, 109,114, 446, 463, 493-496, 500, 502, 504-506, 530].
Это может привести кувеличению экспрессии белковых цепей ферментов дыхательной цепимитохондрий,увеличениюколичестваданныхферментовизапускуфизиологических процессов в клетках, которые, вероятно, защищают организмот атеросклероза [83, 87, 89, 93-95, 97-99, 102-104, 108, 109, 114, 446, 463, 493496, 500, 502, 504-506, 530].Однонуклеотиднаязаменаm.1555A>Gтакжелокализованавгенерибосомальной РНК 12S.
Данная мутация, вероятно, стабилизирует рибосому,аналогично m.652insG, вследствие чего может иметь защитный эффект дляклеток интимы артерий [83, 87, 89, 91-93, 98, 99, 102-104, 108, 109, 119, 114,124, 125, 446, 463, 493-496, 500, 502, 504-506, 530].250Мутация m.3256C>T локализована в 25 нуклеотиде гена тРНК-Leu (кодонузнавания UUR), который является последним нуклеотидомв областитерминации транскрипции [83, 87, 89, 94, 98, 99, 102-104, 108, 109, 111, 112,114, 123-125, 446, 463, 493-496, 500, 502, 504-506, 530, 532]. Терминацияпроисходит в том случае, если на А-сайте рибосомы появляется стоп-кодон(UAG, UGA или UAA). Если тРНК, соответствующие даннымотсутствуют, пептидил-тРНК продолжаеткодонам,оставаться связанной с Р-сайтомрибосомы. На этом этапе протеины RF1 или RF2 выполняют функцииузнавания различных кодонов и катализа отсоединения полипептидной цепи отмРНК.
Протеин RF3 вызывает диссоциацию мРНК из митохондриальнойрибосомы. Когда лейцин оказывается последней аминокислотой полипептида,терминации транскрипции не происходит, полипептид не может отделиться отмитохондриальной рибосомы. Это влечет за собой такие негативныепоследствия, как невозможность использования для дальнейшего синтезасубъединиц рибосом, оставшихсясвязанными с полипептидами. Данныеполипептиды также невозможно использовать в обменных процессах.
Поэтомуколичествонормальныхбелковдыхательнойцепивмитохондрияхуменьшается, а иинтенсивность синтеза АТФ падает [83, 87, 89, 94, 98, 99, 102104, 108, 109, 111, 112, 114, 123-125, 446, 463, 493-496, 500, 502, 504-506, 530,532].Однонуклеотидная замена m.3336T>C (ген MT-ND1) является молчащеймутацией, не приводящей к замене аминокислоты в первой белковойсубъединице фермента NADH дегидрогеназы [27, 83, 87, 89, 94, 98, 99, 105,102-104, 107-109, 114, 160, 446, 463, 493-497, 500, 502, 504-506, 530].
Вероятно,связьданноймутациисатеросклеротическимипоражениямиартерийобъясняется тем, что она входит в состав гаплотипа, ассоциированного смитохондриальной дисфункцией [27, 83, 87, 89, 94, 98, 99, 105, 102-104, 107109, 114, 160, 446, 463, 493-497, 500, 502, 504-506, 530].При однонуклеотидной замене m.5178C>A, локализованной в гене второйсубъединицы NADH-дегидрогеназы, происходит замена лейцина на метионин251[45, 83, 87, 89, 90, 94, 98, 99,102-105, 107-109, 114, 124, 125, 446, 463, 482,493-497, 500, 502, 504-506, 530].Данная мутация, вероятно, приводит кдисфункции фермента, способствующей возникновению атеросклеротическихпоражений.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
