Диссертация (1174185), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Корреляция гаплогруппы M с уровнем гетероплазмиимитохондриальных мутаций [89, 499]МутацияКоэффициенткорреляцииАсимптоматическаязначимость(двухсторонняя)m.652delG1,2460,213m.652insG0,0001,000m.1555A>G1,7940,073*m.3256C>T0,0570,954m.3336T>C1,6510,103*m.5178C>A3,3290,001**m.12315G>A0,2230,824m.13513G>A1,0000,317m.14459G>A0,4020,687m.14846G>A0,0660,947m.15059G>A0,7730,440Примечание:- высокодостоверная корреляция гаплогрупп с мутациями (p≤0,05);235- корреляция гаплогрупп с мутациями значима на уровне p≤0,1.Согласно данным таблицы 78, с гаплогруппой M высокодостоверноассоциирована мутация митохондриального генома m.5178C>A, и значимо науровне p≤0,1 – однонуклеотидные замены m.1555A>G и m.3336T>C [89, 499].236ГЛАВА 4.
ОБСУЖДЕНИЕВ атерогенезе большое значение имеют клетки крови. При возникновенииатеросклероза происходит их миграция в интиму-медию через эндотелиальныйслой. Сигнальную роль во время формирования воспалительного и иммунногоответа выполняют лимфоциты, а моноциты превращаются в макрофаги,удаляющиеизлишкихолестерина,которыенакапливаютсявочагахатеросклеротических поражений [89].Одной из возможных причин атеросклероза могут быть дефекты вмитохондриях клеток, благодаря которым может возникнуть недостатокэнергии(АТФ)моноклональнойвклеткахгипотезе,иктканяхорганизма,неограниченнойведущий,пролиферациисогласноклетокивозникновению атеросклеротических поражений [89, 530].
Для того, чтобывыяснить, имеются ли отличия между митохондриями клеток нормальной ипораженнойатеросклерозоминтимысосудов,былпроведенультраструктурный анализ митохондрий с помощью электронного микроскопа.Обнаружено, что, по сравнению с митохондриями клеток нормальной интимы,в митохондриях из участков атеросклеротических поражений имеютсядеструктивные изменениякрист, отек матрикса, вакуолеподобные имиелиноподобные структуры [89].Наоснованиимитохондриях,выявленныхпатологическихизмененийвданныхбыло высказано предположение, что причиной подобныхмитохондриальных дефектов могут быть мутации мтДНК, ведущие кдисфункции ферментов дыхательной цепи митохондрий или транспортныхРНК.
Вероятно, уровень обмена веществ в мутантных митохондрияхснижается, а моноциты с такими митохондриями становятся склонными клипоидозу, в конечном итоге превращаясь в пенистые клетки. Таким образом,пусковым механизмом атерогенеза могут быть мутации митохондриальногогенома [89, 530].237Для того, чтобы проверить данное предположение, было решено провестисравнительный анализ уровня гетероплазмии в выборке индивидов спораженной атеросклерозом и нормальной интимой артерий [89].С целью определения уровня гетероплазмии мутаций митохондриальногогенома в исследуемой выборке автор с коллегами разработали новыйоригинальныйметодколичественнойоценкимутантногоаллелямитохондриального генома, основанный на технологии пиросеквенирования[83, 87, 89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 530, 535]. С помощью разработанногометодаоказалосьвозможнымопределениеуровнягетероплазмиикаксоматических, так и наследственных мутаций мтДНК, а также соматическихмутаций ядерного генома [83, 87, 89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 530, 535].Схема анализа процента гетероплазмии представлена на рисунке 51 [89,495].Метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриальногогенома, разработанный автором с сотрудниками на основе технологиипиросеквенирования [83, 87, 89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 530, 535] обладаетрядом существенных преимуществ по сравнению с другими количественнымиметодами: инвазивного расщепления олигонуклеотидного зонда (Invader), РТРАСА-кПЦР),высокоэффективнойжидкостнойхроматографии(HPLC),анализа гетеродуплексов, анализа гетероплазмии с использованием Surveyornuclease, секвенирования по Сенгеру, SNaPshot, HRM, TGGE, секвенированиянового поколения на оборудовании 454/Roche, Applied Biosystems SOLiD,серии приборов Illumina [89, 154, 158, 179, 202, 215, 231, 239, 271, 293, 298, 303,365, 380, 384, 387, 396, 397, 434, 436, 437, 445, 466, 521, 535, 541, 550, 563, 579],применяемыми для анализа мутаций (таблица 79).
Как видно из таблицы 79,пиросеквенс обладает наименьшим количеством недостатков и наибольшимколичеством достоинств, по сравнению с другими методами измеренияпроцентагетероплазмиимитохондриальногогенома.Онпредоставляетуникальнейшую возможность анализа очень короткого фрагмента ДНК,содержащего область анализируемой мутации. Размер такого фрагмента ДНК, в238среднем, составляет 5-10 п.н., что существенно уменьшает вероятностьдопущенных при анализе ошибок. Вследствие этого метод, разработанныйдиссертантом с коллегами на основе технологии пиросеквенирования [83, 87,89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 530], мог бы служить «золотым стандартом» длявсехостальныхметодовопределениямитохондриального генома и его рекомендуетсяпроцентагетероплазмииприменять для верификацииуровня гетероплазмии мутаций, выявленных с помощью других методов.Рисунок51.Анализпроцентагетероплазмиимутациймитохондриального генома с помощью разработанного метода [89, 495].239Таблица 79.
Сравнение методов количественного анализа ДНК [89,154, 158, 179, 202, 215, 231, 239, 271, 293, 298, 303, 365, 380, 384, 387, 396,397, 434, 436, 437, 445, 466, 521, 535, 541, 550, 563, 579]МетодПреимуществаНедостаткиМетод1. Уникальная возможность1. Необходимопиросеквени-анализа очень короткогоспециальноерованияфрагмента ДНК,оборудованиев среднем 5-10 п.н.2. Эффективность2.
Известна точная природавсех четырехизменения нуклеотидовферментов3. Можно автоматизироватьявляется4. Быстротакритическим5. Можно использовать для SNP-моментоманализадля точности6. Можно анализировать сложныепроцессавторичные структуры7. Относительная дешевизнаанализа мутаций в одном образце.Метод1. Позволяет проводить SNP-1. Требуетинвазивногоанализ в одной реакционнойдлительногорасщепленияпробиркевремениолигонуклео-2. Позволяет использоватьинкубации (3-4 ч)тидного зондаавтоматическую настройку2. Большое(Invader)реакцииколичествогеномной ДНК(20-100 нг)на одну реакцию3.
Трудоемкий240процесс подборааллельспецифичныхзондовРТ РАСА-1. Простой1. СложнокПЦР (коли-2. Одноступенчатыйподобратьчественной3. Быстрыйоптимальныерефракторной4. Нерадиоактивныйаллель-аллельспеци-5. Чувствительныйспецифическиефической6. Специфичныйпраймеры.амплификации2. Сложнов реальномподобратьвремени)оптимальныйрежим для РТПЦР, так чтобыаллельспецифическиепраймерысадились именнона нужнуюпоследовательность.454/Roche1. Высокая длина прочтений1. Высокая2.
Для GSJunior – невысокаястоимость приборастоимость приборадля GSFLX+и эксперимента2. Высокаястоимостьэкспериментадля GSFLX+2413. Высокаястоимость за 1 Мб4. Большой расходрастворов,пропускаемыхчерез проточнуюячейкуIllumina1. Невысокая стоимость1. ОтносительноIllumina MiSeqинструмента и экспериментакороткие2. Самая низкая стоимость за 1 Мб прочтениясреди малых платформи количество3. Самое быстрое время запускапрочтений меньшечем у другихпродуктов Illumina2. Завышеннаястоимость за 1 Мбсреди другихпродуктов IlluminaIlluminaРазносторонние геномныеДля большихHiScanSQисследования и прогноз наобъемов данных –масштабирование характеристикстоимость за 1Гббольше, чему HiSeqIllumina GAIIx1. Стоимость прибора ниже, чем уСтоимость за 1ГбHiSeqбольше, чем2.
Большое количествоу HiSeqпубликаций с использованиемэтого прибора242Illumina HiSeq1. Наибольшее количество1. Высокая1000 и 2000прочтенийстоимость прибора2. Максимальный выход2. Повышенныесеквенирования в день и за 1требованиязапускк платформам3. Самая низкая стоимость за 1 Гбанализасреди всех платформполученногоматериалаApplied1. Каждый канал проточной1. Высокоэффек-Biosystemsпластины может бытьтивные приборыSOLiDпроанализирован независимостали доступными2. Высочайшая точностьлишь с серединысеквенирования2011 года3. Возможность возобновления2.
Относительнонеудачных цикловкороткиесеквенированияпрочтения4. 96 различных адаптеров для3. Большеекаждого каналаколичество5. Пропускная способность 10–15пробеловГб день для SOLID-5500при сборкеи 20–30 Гб/день для SOLiDгеномов5500XL4. Высокаястоимость приборадля SOLiD-550XLМетод HRM1.
Низкое потребление реагентовМетод неанализас незначительными потерями:адаптирован длятребуется всего лишь 20 мкл ПЦР- количественногосмеси для анализа каждого образца, анализа процента243исключая потребность в HPLC-гетероплазмиирастворителях или DGGE-геляхмитохондриаль-2. Этап высокочувствительногоных мутацийанализа кривых плавления можетбыть просто добавлен в конце ПЦРдля немедленного анализа3. В отличие от DHPLC, нетребуется термическаяоптимизация4. Низкое потребление образцов:после проведения HRM-анализапродукты ПЦР могут бытьиспользованы в реакциисеквенирования по Сенгеру5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
