Диссертация (1173332), страница 9
Текст из файла (страница 9)
ед.)Также определяли характеристику потока эритроцитов «σ» – среднееквадратическое отклонение – статистически значимые колебания скоростиэритроц тов. Величина σ существенна для оценки состояния микроциркуляции исохранности механизмов ее регуляции. Соотношение между перфузией ткани ивеличиной ее изменчивости (флаксом) оценивалось коэффициентом вариации –Kv (%), характеризующим вазомоторную активность микрососудов:62Kv = σ/М 100 (%), где М – показатель микроциркуляции.Представленные в амплитудно-частотном спектре ЛДФ-граммы колебанияукладываются в диапазоне частот от 0,05 до 2 Гц.Исследования проводили аналогично на сроках 1, 3, 6 месяцев всоответствиисрезультатами,полученнымивэкспериментальныхилабораторных исследованиях.Длястатистическойобработкирезультатовлабораторныхиэкспериментальных исследований применяли метод доверительных интервалов назаданном уровне значимости.Объем выборок для испытаний рассчитывали по обобщенной формуле Лера[30].Доверительные интервалы медианы вычисляли по Кобзарю А.
И. (2006) [8].Стандартные коэффициенты корреляции, которые считали достоверными,определяли по Каминскому Л. С. (1964) [7].63ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1. Результаты скрининга остеопластических материаловПротокол изучения: MTT 13.12.2014 19:21:26Формат планшета:96 лунокСостояние оптической плотности(Фильтр 1: 540 нм) путем контроляактивности митохондриального дыхания фибробластов 3Т3/NIH123456789101112A 0,136 0,148 0,165 0,257 0,195 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044B 0,258 0,264 0,321 0,172 0,189 0,044 0,044 0,236 0,133 0,327 0,219 0,043C 0,046 0,341 0,491 0,336 0,376 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044D 0,048 1,086 0,752 1,126 1,261 0,044 0,043 0,229 0,273 0,283 0,241 0,044E 0,049 0,405 0,755 0,668 0,045 0,044 0,044 0,045 0,044 0,044 0,044 0,044F 0,049 0,164 0,178 0,222 0,294 0,044 0,046 0,045 0,044 0,044 0,044 0,044G 0,050 1,030 0,238 0,333 0,047 0,045 0,045 0,044 0,044 0,044 0,045 0,045H 0,052 0,051 0,049 0,048 0,049 0,047 0,049 0,045 0,045 0,047 0,045 0,044А1 – А5 коллопан мытыйВ1 – В5 коллопан сухойС2 – С5 Easy-Graft мытыйD2 – D5 цитодекс №3E2 – E4 Bio-Oss сухойF2 – F5 Lioplast сухойG2 – G4 Easy-Graft сухойB8 – B11 Bio-Oss мытыйD8 – D11 Lioplast мытый643T3 4 суток на матриксах стандартных 13.12.20141,2OD10,80,60,40,20Рис.
38. МТТ Уровень оценки адгезионных и пролиферативных свойствмикроносителей для стволовых клеток.При оценке адгезионных и пролиферативных свойств микроносителей наоснове остеопластических материалов с использованием стандартных клеточныхлиний и первичных культур стволовых клеток из десны при созданиитканеинженерной конструкции с использованием аутогенных остеобластов длялечения заболеваний пародонта установлено, что ни один из исследуемыхзарубежных и отечественных материалов не обладает выраженными адгезивнымии пролиферативными свойствами. В результате серии экспериментов in vitroустановлено, что отмывание образцов костных материалов значительно ухудшаетих адгезивные и пролиферативные свойства.
При создании тканеинженернойконструкции, направленной на восстановление дефекта костной ткани челюстей сиспользованиемаутологичныхклеток,оказалось,чтосамымилучшимипролиферативными и адгезивными свойствами обладает остеопластическийматериал зарубежного производства Bio-Oss. Отмывание образцов буфернымраствором ухудшило пролиферативные и адгезивные свойства всех материалов,кроме остеопластического материала Lio plast, свойства которого улучшились.Усовершенствованная методика культивирования аутологичных клеток иоценкаизмененияостеопластическихадгезивногоипролиферативногопотенциала65материаловпослеоптимизацииихсвойствпозволилиразработатькомпозиционный материал для замещения костных дефектов челюстей (патент №2 685 148) и способы его изготовления и применения (патент № 2 692 452.).Композиционный материал для замещения костных дефектов состоит изсмеси гранулированного синтетического ГА и бета-трикальций фосфата и МСКлабораторного животного, при этом гранулы ГА стандартизированы по форме,имеют размер частиц 150–400 мкм и имбибированы МСК, культивированными изприкрепленной десны кролика.Техническимрезультатомизобретенияявляетсявосстановлениеархитектоники костной ткани путем стимулирования регенерации костной тканикомпозицией с аутологичными остеоиндуктивными и остеокондуктивнымисвойствами.Композиционный материал для замещения костных дефектов получаютследующим образом:У кролика под инфильтрационной анестезией хирургическим скальпелемосуществляется забор поверхностного слоя слизистой оболочки прикрепленнойдесны.
Полученный фрагмент помещается в 0,05% раствор коллагеназы 2-го типана 16 часов в термостат при +37ºС с дальнейшим проведением пипетированияосадка и добавления полной питательной среды, состоящей из DMEM/F12(Invitrogen,США),содержащей10%телячьюфетальнуюсыворотку(«HyCloneDefined», HyClone, США), инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гентамицина.Культивирование МСК осуществляли в стандартных условиях в СО2-инкубаторес концентрацией СО2 5%, атмосферного воздуха 95% и с повышеннойвлажностью. Стандартизованную дифференцировку МСК осуществляли всоответствии с протоколами STEMPRO® MSCSFM; StemPro® AdipogenesisDifferentiationKit;StemPro® ChondrogenesisDifferentiationKit;StemPro®Osteogenesis Differentiation Kit.
Иммунофенотипирование осуществляли напроточном цитофлуориметре Gallios (Бекман Культер, США). Анализ проводилипри помощи ПО AN43172 Software Version.66Вторымэтапомлабораторногоисследованияявиласьразработкаоптимальной методики проверки и, в случае необходимости, снижениепирогенности и цитотоксичности остеопластического материала для успешногоимбибирования аутологичными клетками.Дляоценкиостеопластические«ЛиоПласт»,пролиферативногоматериалызарубежногопотенциалаотечественногопроизводствабылипроизводства«Bio-Oss»,выбраны«Коллапан»,«Easy-Graft».Данныематериалы были выбраны, поскольку они часто применяются и относятся кразным группам остепластических материалов.
В качестве контроля былиспользован «Цитодекс» – микроноситель для культур клеток.В качестве клеточной культуры использованы клетки, рекомендованныеГОСТ и ISO для скрининговых исследований – линейные фибробласты 3Т3/NIH.Перед проведением исследования была проведена стандартизация образцовпо размерам.3.2. Результаты морфологического изучения костной ткани нижнейчелюстикроликапослеимплантацииразработаннойкомпозициикомпозиционного материала для замещения костных дефектовЦелью проводимого исследования являлось морфологическое изучениекостной ткани нижней челюсти кролика после имплантации разработаннойкомпозиции композиционного материала имбибированного аутологичнымиклетками, полученными из десны кролика, для замещения костных дефектов.Была изучена костная ткань в области дефекта тела нижней челюсти у 12кроликов. В опытной группе в искусственно созданный костный дефект слеваимплантировалась разработанная композиция, фиксированная на Bio-Oss, саутологичной МСК из слизистой оболочки полости рта.
В контрольной группесправа вводился только Bio-Oss.Животных выводили их эксперимента на 1, 3, 6 месяц. Костную ткань вобластидефектавыпиливалиификсировалив10%формалине,декальцинировали, заливали в парафин. Срезы толщиной 4–5 мкм окрашивалигематоксилином и67эозином, по Ван-Гизону. Просматривали на универсальном микроскопе LeicaDM400Bпристандартнойсветовоймикроскопии,фазово-контрастноймикроскопии и микроскопии темного поля.Порезультатамисследованиявопытнойгруппечерез1месяцгистологическая картина препаратов четырех кроликов была схожа.
Костныйдефект заполнен фрагментами (материала Bio-Oss), которые полностью лишеныклеток и окрашиваются гематоксилином и эозином с разной степеньюинтенсивности (рис. 39).Рис 39. Опытная группа (1 месяц). Полость дефекта, заполненная фрагментамиBio-OssсаутологичнымиМсктонкаястрелка,вцентрефрагментновообразованной костной ткани толстая стрелка.
Окраска гематоксилином иэозином, ув. х100.При окраске по Ван-Гизону фрагменты окрашиваются фуксинофильно сразной степенью интенсивности. При фазово-контрастной микроскопии вкостных фрагментах выявляется фибриллярная структура ткани (рис. 40).68Рис. 40. Опытная группа (1 месяц). Тонковолокнистая структура фрагментов BioOss. Нормальная структура новообразованной кости. Окраска гематоксилином иэозином, ув.
х200.Микроскопия в темном поле также выявляет фибриллярность структурыфрагментов Bio-Oss, но структура при этом значительно отличается от структурыздоровой костной ткани (рис. 41).Рис. 41. Опытная группа (1 месяц). Тот же участок при микроскопии темногополя. Значительное различие структуры фрагментов Bio-Oss и новообразованнойкости, ув. х200.69При поляризационной микроскопии костные фрагменты анизотропны, т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
