Диссертация (1173332), страница 7
Текст из файла (страница 7)
13) – это искусственный гидроксиапатит в комбинации с коллагеном илинкомицина гидрохлоридом.Рис. 12. ОстеопластическийРис. 13. Остеопластическийматериал «ЛиоПласт».материал «Коллапан».«Easy-Graft» (рис. 14) – это кристалический синтетический остеопластическийматериал.«Bio-Oss» (рис. 15) – натуральный остеопластический материал на основе бычьейкостной ткани.Рис. 14. ОстеопластическийРис. 15. Остеопластическийматериал «Easy-Graft».материал «Bio-Oss».40В качестве контроля был использован «Цитодекс» – микроноситель длякультур клеток.Вкачествеклеточнойкультурыбылииспользованыклетки,рекомендованные ГОСТ и ISO для скрининговых исследований, – линейныефибробласты 3Т3/NIH.2.2.2.
Метод подготовки остеозамещающего материала для определенияцитосовместимости (скрининга)Образцы остеопластических материалов были приведены к приблизительноодному размеру и форме (гранулы 150–400 мкм) путем стерильного измельченияпри температуре жидкого азота.Далее образцы остеопластических материалов отмывали (серия №2) взабуференном физиологическом растворе следующим образом:1. Образцы были разложены в одинаковом количестве в стерильныепробирки объёмом 2 мл в 4 повторах.2. В каждую пробирку вводили 2 мл забуференного физиологическогораствора и встряхивали на лабораторном шейкере (Elmi) 60 сек, после чего давалиматериалу осесть и супернатант удаляли отсасыванием.3.
Отмывку повторяли 3 раза.4. К отмытому материалу добавили 1 мл питательной среды и поместили на24 часа в СО2-инкубатор, к непромытому материалу также добавили среду на 24часа для проверки стерильности.Серия №1 состояла из измельченных неотмытых образцов.Для проведения скрининга остеопластических материалов при исследовании пролиферативной активности применяли перевиваемую линию фибробластов3Т3/NIH, которая входит в список рекомендованных ГОСТ Р ИСО 10993.5-99.Считая, что поверхность гранул с контролем (50 мкл суспензии Цитодекс№3) составляет 8 см2, была рассчитана посевная концентрация клеток линии 3Т3,которая составила 30% от 100% монослоя. Конечный объём среды после засевасоставил 1,5 мл (рис.
16).41Пробиркисобразцамиматериаловсклеткамипомещаливпрограммируемый ротатор RM-1 (Elmi) (рис. 17), скорость вращения 2 об/мин.Культивирование продолжали в ротаторе, помещенном в термостат, в течение 96часов при 37°С.Рис. 16. Образцы материаловРис. 17. Программируемый ротаторс клетками.RM-1 (Elmi).Для анализа пролиферативного ответа клеток-эффекторов на различныемитогенные, ростовые и дифференцировочные факторы, а также для определенияжизнеспособности клеток при или без воздействия различных агентов применялсяметод митохондриального дыхания.Метод основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живыхклеток конвертировать растворимую тетразолиевую соль 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолиумбромид(МТТ)внерастворимыйформазан.Интенсивность окраски линейно коррелирует с количеством жизнеспособныхклеток в суспензии.По прошествии 96 часов культивирования из каждой пробирки удалили 0,7мл среды и внесли 0,2 мл раствора МТТ (в забуференном физиологическомрастворе в концентрации 1мг/мл) на 3 часа при вращении, что приводило кобразованию на дне фиолетовых нерастворимых в воде кристаллов.42Через3часаинкубациипробиркисматериаломиклеткамицентрифугировали 5 мин при 1500 об/мин.
Супернатант удалили отсасыванием ик осадку добавили 350 мкл диметилсульфоксида. Каждую пробирку встряхивалина лабораторном шейкере (Elmi) 10 сек для растворения кристаллов формазана,которые образовались как на поверхности гранул, так и в порах.Рис. 18. Спектрофотометр Multiskan FC (Thermo).Материалу дали осесть и из пробирок перенесли по 150 мкл растворадиметилсульфоксида в 96-луночную плашку для измерения оптической плотностипри длине волны 540 нм на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo) (рис. 18),что служило показателем активности митохондриального дыхания клеток.Сканирующаяэлектроннаямикроскопия.Дляморфологическойхарактеристики клеток, прикрепленных к гранулам носителей, образцы заселяликлетками, культивировали и готовили препараты для сканирующей электронноймикроскопии [3]. Образцы напыляли слоем золота (10 нм) в аппарате Eiko IB3(«Eiko») и анализировали с помощью сканирующего электронного микроскопаS570 («Hitachi») при ускоряющем напряжении.432.3.
Материалы и методы экспериментальных исследований наживотных.Задачей экспериментальной части работы явилась сравнительная характеристиканаправленной регенерации костной ткани нижней челюсти кролика послемоделирования костных дефектов и заживления костных ран в условияхестественного течения процесса при использовании препарата Bio-Oss c однойстороны и клеточной культуры с костным препаратом с противоположнойстороны челюсти.Экспериментальная модель дефекта заключалась в формировании костныхполостей у кроликов в области тела нижней челюсти справа и слева.
Изучениеанатомического строения нижней челюсти кроликов подтвердило мнение о том,что кость в области угла и ветви нижней челюсти имеет толщину 0,3–2,3 мм иприкрыта толстым слоем мышечной ткани. Тело челюсти на уровне 2 и 3 зубовимеет толщину 7,2 и 11,4 мм и расположено наиболее близко к поверхности кожи.В связи с этим формирование полости осуществляли в области тела нижнейчелюсти на уровне 2 и 3 зубов.Для эксперимента использовали 10 кроликов породы «Шиншилла» (рис.
19)в возрасте 5–6 месяцев и массой тела от 2 до 3 кг. Животным в подчелюстныхобластях выстригали ножницами шерсть, а затем выбривали ее. Перед операциейпроизводили премедикацию препаратом Рометар 0,5 мг внутривенно, животноеукладывали на специальный станок и фиксировали конечности.Операцию осуществляли с соблюдением правил асептики под общимнаркозом (Золетил 50) 0,5 мл внутримышечно (рис. 20).44Рис. 19. Кролики породы «Шиншилла».Рис. 20. Проведение внутримышечного наркоза кролику.Техника операции.
После местного обезболивания в подчелюстнойобласти слева производили линейный разрез длиной 35–40 мм, рассекая при этомкожу, подкожную жировую клетчатку, фасцию (рис. 21). Тупо разводили мышцы.Осуществляли тщательный гемостаз. По нижнему краю тела нижней челюстирассекали надкостницу на протяжении 30–35 мм и распатором отслаивали еекверху, тем самым обнажая наружную поверхность тела нижней челюсти науровне 2 и 3 зубов (рис. 22).45Рис.
21. Проведение разреза в подчелюстной области.Рис. 22. Скелетирование тела нижней челюсти.С помощью бормашины и фрезы (рис. 23) с ограничителем у всех животныхсоздавали в теле нижней челюсти костную полость (рис. 24). Такую же операциювыполняли справа.46Рис. 23. Портативная стоматологическая установка.Рис. 24. Формирование дефекта нижней челюсти.В сформированные костные полости на нижней челюсти слева послеоперации заполняли МСК вместе с костным материалом Bio-Oss (рис.
25),накладывали резорбируемую мембрану BioGide.47Рис. 25. Внесение в интраоперационный дефект остопластического материалаBio-Oss, инфильтрированного МСК.Рис. 26. Внесение в интраоперационный дефект биорезорбируемой мембраныBioGuade.48Дефект,сформированныйсправойстороны,заполняликостнымматериалом Bio-Oss, перемешанным с кровяным сгустком, накладывалирезорбируемую мембрану BioGide (рис.
26). После заполнения костных полостейуказанными имплантатами мягкие ткани над ними послойно ушивали наглухо(рис. 27). На надкостницу, мышцы и фасции накладывали погружные швыкетгутом, края раны сшивали узловыми швами из шелка.Рис. 27. Послойное ушивание раны.Послеоперационную рану кожи обрабатывали антисептическим раствором.Впослеоперационномпериодеосуществляликлиническоенаблюдение,применяли антибиотик Байтрил 0,5мл внутримышечно курсом 7 дней.Животных выводили из эксперимента на 30, 90 и 180 сутки по 4 животныхна каждый срок в каждой группе путем внутрибрюшинного введения калипсола вдозе 750 мг/кг и листенона в дозе 200 мг/кг массы экспериментальногоживотного.49Далее проводилось скелетирование челюстей (рис.
28).Фрагмент челюстной кости, содержащий дефект, фиксировали в 70° спиртев течение 10 суток (рис. 29) и декальцинировали в растворе трилона-Б в течение 3недель. После отмывания образцов в спирте их заливали в парафин. Парафиновыесрезы толщиной 4–5 мк окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксиномпо Ван-Гизону для выявления коллагеновых волокон и толуидиновым синим длявыявления кислых гликозаминогликанов.Рис. 28. Скелетированный фрагмент челюсти экспериментального животного.50Рис.
29. Образцы экспериментальной кости животного, фиксированныев формалине.2.4. Материалы и методы рентгенологического исследования.Для подтверждения эффективности разработанной методики остеогенезаинтраоперационного дефекта с использованием остеозамещающего материала,насыщенногоаутологичнымиклетками,былапроведенаприжизненнаямультиспиральная компьютерная томография кроликов с использованиемаппарата Astei on 4 (рис.
30) через 1, 3 и 6 месяцев послеоперационного периода.Этасистемаявляетсяодносрезовымспиральнымкомпьютернымтомографом с возможностью модернизации до мультисрезовой платформы.Рабочая станция Vitrea 2 обеспечивает улучшенную 2D и 3D визуализацию,а также анализ, предоставляя врачу возможность подготовить отчет о пациенте засчитанные минуты. Станция Vitrea 2 предлагает исключительную скоростьформирования изображений, диалоговую процедуру работы и предварительноустановленные клинические протоколы. В таблице 2 представлены техническиепараметры мультиспиральной компьютерной томографии лицевого отдела черепа.51Таблица 2 – Технические параметры мультиспиральной компьютернойтомографии лицевого отдела черепаПараметрЗначениеТопограмма (боковая)угол обзорапротяженностьkV120mAСпиральное сканированиетолщина среза1,0msec750kV120mAs/slice97разрешениевысокоеmA130KrnFC01время вращенияполе обзорафильтрокноматрицасредняя эффективная дозакостныйc – 500 w – 200052Рис.
30. Мультиспиральный компьютерный томограф Toshiba Asteion VP.Позиционирование осуществляется по лазерным меткам в положениикролика лежа. Анатомическая область сканирования определяется по топограмме(surview) – лицевой череп полностью. Срезы параллельны твердому небу (линии«улыбки») и в состоянии привычной окклюзии.2.5. Материалы и методы клинического исследования.Изучение клинической эффективности биокомпозиции с аутологичнымиМСК десны для лечения пациентов с послеоперационными дефектами челюстейпроводилось в Клиническом центре стоматологии ФГБОУ ВО «МосковскийГосударственный Медико-Стоматологический Университет им. А.
И. Евдокимова»Минздрава России.Характеристика групп исследуемых пациентов. За период с 2014 по 2017 гг. былопроведено обследование 148 пациентов в возрасте от 22 до 50 лет с патологией,требующей хирургического вмешательства с образованием в процессе лечениякостных дефектов челюстей. Из них 53 человека дали информированное согласие научастие в исследовании.53Всоответствииспланомпроводимойклиническойапробации,подтверждающей эффективность разработанной методики, были разработаныкритерии включения, не включения и исключения пациентов из исследования:Критерии включения пациентов в исследование:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
