Диссертация (1173332), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Однако применение остеопалстических материаловдля восстановлениякостной ткани челюстей производилось без выбора наиболее биосовместимого ицитосовместимого с аутологичными мезенхимальными стволовыми клеткамивыделенными из десны. Важность проблемы эффективного восстановлениякостной ткани челюстей, при различных видах протезирования, а так женеобходимостьсочетанногоиспользованияостеопалстическогоматериаласовместно с аутологичными мезенхимальными ствловыми клетками полученныеменее травматичным способом из десны, позволило нам сормулировать нам, целии задачи настоящего исследования.30ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯЭкспериментальный раздел работы выполнен на кроликах породыШиншиллав возрасте 5–6 месяцев и массой тела от 2 до 3 кг, содержащихся ввиварии на стандартном рационе питания со свободным доступом к воде.Припланированиибиоэтическимиипроведенииисследованийпринципамиобращениясруководствовалисьживотными,утвержденныеЕвропоейской конвекцией о защите позвоночных животных, используемых дляэкспериментов или иных научных целях (2005) и в соответствии с правиламилабораторной практики, утвержденными приказом Минздрава России №708 от23.08.20102.1. Работа с культурами мезенхимальных стволовых клеток издесныРаботы с культурами клеток проводили в ЦКП «Регенеративная медицина»Сеченовского университета в зоне чистых помещений классов Д–А (7–5 класс поИСО).Задачами лабораторной части работы явились усовершенствование методиккультивирования аутологичных клеток из ткани десны для создания прототипабиомедицинского клеточного продукта с целью дальнейшего использования внаправленной тканевой регенерации в условиях объемного дефекта костнойткани.2.1.1.
Забор биоматериала-источника клетокДля получения культуры МСК был проведен забор фрагмента ткани десныкролика размером 3×3×1 мм в условиях операционной.Оперативное вмешательство проводилось под общим наркозом препаратомЗолетил 0,5 мл (рис. 1) внутривенно с предварительной премедикацией Рометаром310,5 мл (рис. 2) внутримышечно.Рис. 1. Седативное средство дляРис. 2.
Средство для общейпремедикации «Рометар».анестезии «Золетил».Операцию проводили с соблюдением правил асептики и антисептики. Скальпелемпроизводили треугольный разрез длиной 3–4 мм, тщательно выполняли гемостаз.Полученный биоматериал помещали в стерильный контейнер транспортнойсредой, содержащей питательную среду DMEM (Gibco) и 3% пенициллинастрептомицина (Gibco), и транспортировали при +20°С в процессинговуюлабораторию (рис. 3).Рис.3. Исследуемые клетки эпителия в пробирках.322.1.2.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток из десны кроликаФрагмент десны в условиях чистых помещений и ламинарном потокестерильного воздуха помещали в раствор 0,05% коллагеназы 2-го типа (Invitrogen)на 16 часов в термостат (Thermo Fisher Scientific) при +37°С. После ферментациипроводили пипетирование осадка, центрифугирование полученной суспензии при350 g.
К осажденным фрагментам добавляли полную питательную среду,состоящую из DMEM/F12 (Invitrogen, США), содержащего 10%-ную телячьюфетальную сыворотку («HyCloneDefined», HyClone, США), инсулин 0,4 мкМ, 0,25мг/л гентамицина, и проводили пипетирование. Полученную суспензию высевалив культуральный флакон Т25 (Thermo Fisher Scientific, США) площадью 25 см2.2.1.3. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток издесны кроликаКультивирование осуществляли в стандартных условиях в СО2-инкубаторес концентрацией СО2 5%, атмосферного воздуха 95% и с повышеннойвлажностью. Замену культуральной среды на свежую осуществляли каждые 72часа.Пассирование клеток осуществляли следующим образом: после образованиясубконфлюэнтного монослоя (80–90% площади культурального пластика) клеткиоднократно отмывали раствором Версена, затем снимали с помощью раствораВерсена с 0,25% трипсином, центрифугировали при 350 g, убирали надосадок,осадок ресуспендировали в полной питательной среде и разливали в новуюкультуральнуюва посуду.2.1.4.Замораживание,криохранениеиразмораживаниемезенхимальных стволовых клеток из десны кроликаОставшиесяклеткизамораживаливстандартныхусловияхсиспользованием среды для заморозки (90% фетальная бычья сыворотка HyClonedef, HyClone inc., США; 10% DMSO Hybrimax, Life Technologies, США) ипрограммного замораживателя Planner, после чего помещали в дьюары с жидкимазотом в криохранилище.33Образцы МСК из десны размораживали и оценивали жизнеспособность спомощью счетчика клеток Biorad TC10 по рекомендованному производителемпротоколу (жизнеспособность всех образцов МСК из десны разных пассажейбыла более 80%).2.1.5.
Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток из десныкроликаСтандартизованную дифференцировку МСК костного мозга осуществляли всоответствии с протоколами STEMPRO® MSCSFM; StemPro® AdipogenesisDifferentiationKit;StemPro® ChondrogenesisDifferentiationKit;StemPro®Osteogenesis Differentiation Kit (Invitrogen, США).2.1.6. Иммунофенотипический анализ культур мезенхимальныхстволовых клеток из десны кроликаКлетки, культивируемые на 3–4 пассаже, снимали с культуральногопластика, фиксировали в 4% параформальдегиде (Merck), промывали фосфатносолевым раствором и инкубировали с первичными антителами 40 минут при 4°С.Затем клетки снова промывали фосфатно-солевым раствором и инкубировали совторы- ми антителами, меченными флуорохромами, в течение 40 минут при 4°С втемноте.
В работе использовали моноклональные антитела, CD73 (экто-5"нуклеотидаза), CD90 (Thy-1), CD105 (эндоглин) и CD45 (LCA), меченныефлуорохромами FITCH, TRITC, APC («BD Biosciences», «Abcam», «SantaCruz»).ПримерпрофиляклеточнойкультурыМСКиздесныкролика,подтверждающий профиль клеток по маркерам, входящим в список критериев СКмезенхимального происхождения, представлен в таблице 1.34Таблица 1 – Профиль клеточной культуры МСК из десны кроликаМаркерПроцент экспрессирующих клеток (%)Средняя интенсивностьфлуоресценции (MFI), у.
е.CD451,6824,3CD7399,5017,8CD9099,57116CD10599,4339,6CD1179,391,8335Рис. 4. Цитометрия культивированных МСК из десны кролика на 3 пассаже.Рис. 5. Цитометрия культивированных МСК из десны кролика на 3 пассаже.Рис. 6. Цитометрия культивированных МСК из десны кролика на 3 пассаже.36Рис. 7. Цитометрия культивированных МСК из десны кролика на 3 пассаже.Рис. 8. Цитометрия культивированных МСК из десны кролика на 3 пассаже.2.1.7. Хондрогенная дифференцировка культур мезенхимальныхстволовых клеток из десны кроликаКлеткиснималискультуральногопластика,центрифугироваливполипропиленовых пробирках по 200 тыс. клеток на пробирку. К осадкудобавляли хондрогенную среду StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit иинкубировали 21 сутки в пластиковой посуде со сниженной адгезией –центрифужнойпробиркегликозаминогликановобъемомвнеклеточного15мл.матриксаДлявыявленияпроводиликислыхфиксацию4%параформальдегидом и инкубировали в 1% растворе альцианового синего (pH =1,0, «Biomedicals»).37Рис.
9. Хондрогенная дифференцировка МСК из десны кролика.2.1.8. Адипогенная дифференцировка культур мезенхимальныхстволо- вых клеток из десны кроликаКультуры, достигшие 70–80% конфлюентности монослоя, инкубировали вадипогенной среде StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit. Для выявлениялипидныхвключенийклеткификсировали4%параформальдегидомокрашивали Oil Red O («BioOptica»).Рис. 10. Адипогенная дифференцировка МСК из десны кролика.и382.1.9.
Остеогенная дифференцировка культур мезенхимальныхстволовых клеток из десны кроликаКультуры МСК десны кролика на 3–4 пассаже в состоянии 70–80%конфликтного монослоя инкубировали в остеогенной среде StemPro® OsteogenesisDifferentiation Kit. Культуральную среду меняли каждые 3-е суток.Для выявления очагов минерализации клетки фиксировали 70% этанолом(Ферейн) и обрабатывали 40 мМ водным раствором ализаринового красного S (pH= 4,1, «ПанЭко»).
Для оценки количества связавшегося красителя минеральныеотложения растворяли уксусной кислотой и измеряли оптическую плотность придлине волны 405 нм за вычетом фонового значения при 620 нм с помощьюпланшетного фотометра «Anthos Reader 2020» («Anthos Labtec»).Рис. 11. Остеогенная дифференцировка МСК из десны кролика.2.2.
Материалы и методы создания прототипа биомедицинскогоклеточногопродуктанаосновеостеозамещающегоматериалаиаутологичных клетокПри создании прототипа биомедицинского клеточного продукта изучаликоммерчески доступные остеопластические материалы на цитотоксичность сиспользованием линейных клеточных культур и на цитосовместимость с МСКдесны кролика.392.2.1.
Остеопластические материалы для скрининга на линейныхклеточных культурахДляоценкиостеопластическиепролиферативногоматериалыпотенциалаотечественногобылипроизводствавыбраны«Коллапан»,«ЛиоПласт», зарубежного производства «Bio-Oss», «Easy-Graft».Эти материалы были выбраны, так как они относятся к разным группамостепластическихматериалов.Так,материал«ЛиоПласт»(рис.12)отечественного производства представляет собой деминерализованное губчатоевещество костной ткани. Отечественный остеопластический материал «Коллапан»(рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
