Диссертация (1173319), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Протоколы задчдетекции назывлгенотипа черзобразцовВыделение ДНК из задч40-50 мкл назывлслюны черзпроводили с задчиспользованиемзакончегнабора нокчательGentra продлжающейсяPuregene человкаCore Kit черзA\B. ДНК расшияетрастворяли в 100 мкл ставиводы, закончегзатем2-3 мкл ученограствора обрывкииспользовали для постуаельнмизмерения постянконцентрации наздраствора ДНК в опытнйнаборе DNA явленийBroad границRange и задчQubit полжитеьнм2.0.
постуаельнмКонцентрация движенвыделенной ДНКперваяколебалась от ные1,49матрильдо полжитеьнг74,3 человканг\мкл, геомтричсксреднее наукезначение обманчивсоставило приме18,4 толькнг\мкл.Для нескольосуществления удаляющемсреакции значеисеквенирования по неразшимяСэнгеру движеняампликонов,синомполученных в ескончтьюбрезультате несовршйамплификации чистоцелевых бескончтьюучастков линейгенов источнкмCOL1A1 и несовршйCOL3A1 кругомиспользовали простанвпраймеры бескончтиCol1A1f1 \r1 и геомтричскCol3A1f1\r1 бескончтисоответственнои постян набор неопрдл реактивов имено BigDye постуаельнмTerminator явлетс v3.1 вперд Cycle действильно Sequencing Kit изучает (LifeTechnologies). Дляразвитепроведенияявлющейс реакции невробыликругом созданы полжитеьнм следующие точныхнеобходимые наяусловия:полжитеь1) теряюнагрев абсолютныеблока при изучаеттемпературе обуслвиаетя95°С в задчтечении 2 бескончтьюмин.;2) теряюденатурация ДНК при абсолютныетемпературе 95 °С в изучаеттечении 20 обуслвиаетясек.;3) теряюотжиг абсолютныепраймеров при изучаеттемпературе 55 °С в обуслвиаетятечении 20 задчсек.;4) теряюэлонгация при 60 °С в абсолютныетечении 4 изучаетмин.теряюВыполнялось35 абсолютныециклов.целостн40Результаты теряю реакции абсолютные секвенирования поизучает Сэнгеру обуслвиаетя определялисзадчиспользованием бескончтьюгенетического знаияанализатора ABI время3730XL знаие(Life развитеTechnologies).Для теряюпары абсолютныепраймеров изучает1801184f1\ r1 обуслвиаетябыло задчпоказано, что в бескончтьюдиапазонезнаиятемператур время 62-68° С знаие отсутствуют развите дополнительные теряю продукты, расуждя кроменескольцелевого, юслаботь максимальная будет интенсивность внешго амплификации всеобщнть наблюдается ввперддиапазоне абсолютные62-64° С.
опытнйПоэтому обуслвиаетя синтез концапродукта ПЦР на научомсеквенированиевидтсяосуществляли при матеичскследующей томупрограмме значеиПЦР: 95° С - 5 явлетсмин, 95° С – 30 величнысек,64° С – 30 наукисек, 72° С – 40 сек в 42 толькциклах.Результат задчсеквенирования c знаиепраймера установлеия1801184f1 целостн(файл в бескончтьформате время*.ab1)поискограничеымискомымразвитполиморфизмом [ T/C]CCAGGTG. дальнейшм Нуклеотид, продлжающейся находящийся различсь слева откругомобнаруженной веко подпоследовательности, примезаносили в невро таблицу наблюдемрезультатоввидтсясмылеоткрывали вкругомпрограммеподпоследовательностибескончUgene.указноДалеегоризнтуосуществлялиполжитеьнм CCAGGTG, размеы граничащей поставленясправа скругомполжитеьнйгенотипирования. разешитьПротокол был значеипроверен на постянтестовых плохйобразцах. На ученогрисунке3 теоричскприведен постянпример наблюдемпоиска своемуподпоследовательности и геомтричскобнаружения потребнсиискомого удаляющемсгенотипа в теоричскточке знаирасположения чистополиморфизма.Рисунок 3.
можетПоиск котраяподпоследовательности CCAGGTG и расшияетцелевого законвнуклеотида теряюполиморфизма41Проверка дать специфичности прийт показала, что беспорна пара несовршй очень бескончтью хороша итомунеспецифичных знаие коротких мглази продуктов не всегда ожидается, сказть ожидаемая источнкм длиназаконмерстипродукта обуслвиаетясоставляет 534 наукип.о.Для останея пары развитпраймеров времяCl18Af2/r2 потребнсибыло полжитеьнмпоказано, что в нескольдиапазонетеряютемператур закончег70°-72°С развилоськоличество втораядополнительных абсолютныенецелевых плохйпродуктов ПЦР движеняминимально, но так как при бескончтьютемпературе 72 С наздинтенсивность ПЦР простанверезкополжитеьнпадает и настоящесильно конечыснижается чисто выход знаий целевого котрмуампликона, разешитьбыло плохй решенослаботьюостановиться на сином температуре 70 С. неразшимя Поэтому плохй синтез знаий продукта ПЦР наматерильнысеквенирование датьосуществляли при наздследующей полжитеьнйпрограмме потребнсиПЦР: 95 С - 5 явлениймин,95°С – 30 потребнсисек, 70°С – 30 нискольсек, 72°С – 40 сек в 42 всеобщнтьциклах.Результат науксеквенирования c смылепраймера отличеCl18Af2 останея(файл в бескончтьюформате знаи*.ab1) смылеоткрывали вижепрограммеподпоследовательностиполжитеьнаяUgene.объектуимено CAGAACGA, бескончДалееближеосуществлялиграничащейдальнейшм слевасполнгпоискзадчепостуаельнм искомым бескончполиморфизмом видтся CAGAACGA[G/A].
томуНуклеотид, точныхнаходящийся задче справа отустановлеияобнаруженной конисль подпоследовательности, законв заносили в глазмитаблицу своемурезультатовназдгенотипирования.Протокол был копроверентльна окнчательтестовых расшияетобразцах.2.3. несовршйМетоды обрывкистатистического смылеанализаПолученные несовршйданные ывкибробыли смылеподвергнуты толькстатистической потребнсиобработке.наукСтатистический бескончтьанализ наукипроводился с целостнпомощью разешитьпрограммы смылеPASW первоначльымStatisticsДля несовршйстатистической обрывкиоценки смыле групп тольк исследования и потребнсиконтроля по неаукгенетическим бескончть факторам наукириска целостнразвития ПТО и НМ разешитьприменялся смылеточныйпервоначльымкритерий знаийФишера.
Для нымпервоачльстатистического ученогсравнения полжитеьнйгрупп обрывкиисследования иразешитьконтроля по юслаботь генетическим теоричск факторам был бесконч применён постян U-критерий полжитеьная МаннаУитни. Уровеньобрывки значимости(p)назывл принимали смыле равным сином 0,05воныеамльрит всех расшияетвышеописанных беспорнасравнениях.Для полжитеьнмопределения беспорнавероятности геомтричскассоциации можетдисфункции однактазового дна с сущетвоани42сочетанием линейполиморфизмов rs1800012 гена COL1A1, rs1800255, rs2236479гена COL3A1, rs1801184 гена COL18A1 слаботьюиспользовался ближеметод смылелогистическойобрывкирегрессии c наукевключением знаийвсех знаиянезависимых наукефакторов. Для развитекоэффициентовзнаимодели опытнйбыла векорассчитана расшияетстатистическая смылезначимость задч(уровень теряюзначимости рзадчепринимался знаийравным настояще0.05).43Глава 3КЛИНИЧЕСКАЯ смылеХАРАКТЕРИСТИКАИЗУЧАЕМЫХ смылеВЫБОРОК3.1.
смылеСравнительная сравнеихарактеристика движенданных линейанамнеза развитепациенток явленийисследуемой и значеиконтрольной человкагруппыВ смылеисследование сравнеивключено 250 движенпациенток. линейКоличественный развите составявленийвыборок значеи пациенток человка исследуемой и геомтричск контрольной размеыгруппы веко представлен вразвилосьтаблице № 1Таблица № 1Количественный смылесостав сравнеипациенток движенисследуемой и линейконтрольной развитегруппКоличество смылепациенток в сравнеивыборкахВыборкипациентокПТОНМИсследуемая смылегруппа3657Контрольная смылегруппа--ПТО+НМЖенщиныбез ПТО смылеи\или НМВсего57-150-100100Как смылеможно сравнеивидеть в движентаблице № 1, линейисследуемую развитегруппу явленийсоставили 150 значеипациенток: 36 человкапациенток с геомтричскпролапсом размеытазовых векоорганов без развилосьнедержания смылемочи,57 задчпациенток со беспримнострессовым внешгонедержанием будетмочи и 57 концапациенток с останеясочетанием указнотазового юпролапсанеспобтьи юстрессовогослаботьвобщенедержания наиболемочи.Средний задчвозраст беспримнопациенток внешгоисследуемой будетгруппы концасоставил останея64,4±13указногода, неспобтьюсредний юслаботьвозраст вобщепациенток наиболеконтрольной будетгруппы величнысоставил знаие62,8±12,5года.Контрольную задчгруппу ноеримбспсоставили 100 внешгопациенток без будетпролапса концатазовыхорганов и указнонедержания неспобтьюмочи.останея44Из 150 задчпациенток беспримноисследуемой внешгогруппы 115 будет(76,6%) концанаходились впостменопаузеуказно(рис 5).
Из 100неспобтью пациенток слаботью контрольной вобще группыпостменопаузе будетнаходились 71 величны(71,0%) знаиепациенток назд(рис. 5).Рис. 4 черзРаспределение наиболепациенток ближегруппы наиболеисследования в бескончсоответствии с глазмипериодом движенярепродуктивной времяфункцииРис. 5 черзРаспределение наиболепациенток ближегруппы наиболеконтроля в бескончсоответствии с глазмипериодом движенярепродуктивной времяфункциивостанеянаиболе45Наиболее черзчастой наиболежалобой у ближепациенток с ПТО наиболеявлялся бескончдискомфорт вглазмиобласти движеняпромежности время81(87,1%). знаияЗатрудненное можетмочеиспускание окнчательотмечали 29 назывл(31,2%), 114 целипациенток борьуотмечали абсолютныепотерю границмочи при сказтьфизических развитнагрузках.наукПациентки опытнйконтрольной нымгруппыпервоачльполжитеьнаяподобных видтсяжалоб не впердотмечали.У 36 котрая(38,7%) бескончтипациенток с ПТО человкадлительность поставленязаболевания отличе(проявление постянпервых вторая симптомов) знаийотмечалось задч менее 5 окнчательлет.
У 27 поставленя (29,03%) теоричск пациентоктеоричсксимптомы ПТО задч отмечались от 5 до 10 внешго лет. У 30 указно (32,27%) бескончть пациентокзаконвдлительность ностидейвль симптомов продлжающейсясоставляла настоящеболее 10 лет научом (рис 6). 15 несколь (16,1%)слаботьюпациенток из 93, развитеимеющих знаиесимптоматический знаиепролапс, постянотмечали своемуразвитиепостуаельнмсимптомов сказтьсразу обманчивпосле полжитеьнаяродов.Рис.
6 оРаспределениелпжитеаьянполжитеьнйпациенток с ПТО по векопродолжительности горизнтусимптомов ближезаболевания.40 полжитеьная(35,1%) из 114 нойплжитеьпациенток, со векострессовым НМ горизнтуотмечали ближесимптомыпоставленянедержания всякиеменее 5 сравнеилет, 38 (33,3%)наблюдемназдпациенток научомотмечали НМ при величныфизических простанвнагрузках от 5 до 10 настоящелет, 36 тому(31,6%) полжитеьнаяпациенток расшияетотмечали НМ при настоящефизическихдвиженянагрузках векоболее10 лет горизнту(рис 7).46Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
