Диссертация (1154746), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Фермент достточно сильно ингибируется продуктами22реакции: мет- и лей-энкефалинами, окситоцином, вазопрессином, веществомР,тиреолиберином[186].ВпервичнойпоследовательностиКПЕприсутствует Ca2+-связывающий домен [235], при этом ионы Ca2+ влияют настабильность фермента и способность к связыванию с цитоплазматическимимембранами [274].Активности фермента и концентрация мРНК КПЕ в мозге исоматических тканях коррелируют между собой [95, 149, 155]. Наибольшеесодержание мРНК КПЕ найдено в пирамидальных клетках гиппокампа, ваденогипофизеипромежуточнойдолегипофиза,базолатеральнойминдалине, глиальных клетках боковых желудочков мозга, супраоптическоми паравентрикулярном ядрах гипоталамуса.
Средние концентрации мРНКфермента у крыс зарегистрированы в промежуточной оливе, таламусе, коремозжечка и медиальном коленчатом ядре. Минимальное содержание найденов бледном шаре, латеральном гипоталамусе, гранулярном клеточном слоегиппокампа и в ретикулярной формации ствола мозга.Важным является тот факт, что концентрация мРНК карбоксипептидазыЕ может быстро изменяться в ответ на воздействия, приводящие в конечномитогекизменениюконцентрациибиологическиактивныхформрегуляторных пептидов или уровня их матричной РНК [8]. При этом в случаесинтеза дефектной (неактивной молекулы КПЕ) (например мутация в гене,кодирующем фермент) нарушается синтез и секреция практически всехбиологически активных пептидов [106, 150, 247].Субстратная специфичность, физико-химические свойства, тканевая,клеточная и субклеточная локализация данного фермента свидетельствуют отом, что карбоксипептидаза Еучаствует в процессинге многих биологическиактивных пептидов, таких как энкефалины, -эндорфин, окситоцин,вазопрессин,АКТГ,меланоцитстимулирующийгормон,нейротензин,вещество Р и многие другие [8, 149, 152].Показано, что активность фермента в экспериментах изменяется в ответна фармакологические воздействия на культуры клеток и организм23животных: введение агонистов и антагонистов нейромедиаторных систем[65, 66, 63, 21], транквилизаторов [31, 25, 28], половых стероидных гормонов[29, 30] и глюкокортикоидов [27], гормонов пептидной природы [45] ипредшественников энкефалинов [35].
КПЕ принимает участие в регуляциионтогенеза [31], и полового созревания [71], вовлекается в формированиеалкогольной и наркотической зависимости [36, 17, 13], принимает участие впротекании стресс-реакции [37, 39, 9, 8, 60], и является, таким образом,одним из важнейших факторов гуморальной регуляции организма.1.2.2.2. Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидазаПервыеработы,свидетельствующиеосуществованиикарбоксипептидазы, отщепляющей остатки аргинина и лизина с С-концасинтетических пептидов, но при этом отличающегося от всех известныхописанных в литературе металлокарбоксипептидаз, проведены на кафедрехимииибиохимииПензенскогогосударственногопедагогическогоинститута в 1993 году [36].
Подробная информация о физико-химическихсвойствах, тканевом, клеточном и субклеточном распределении активностибылаопубликована1995году,фенилметилсульфонилфторид-ингибируемаяферментбылназванкарбоксипептидаза(ФМСФ-КП) [24, 18].Данная, не описанная до этого карбоксипетидаза, отщепляет аргинин илизин с карбоксильного конца предшественников активных форм пептидов.Фермент имеет молекулярную массу 100-110 кДа и обладает максимальнойкаталитической активностью при значении pH 6,0-6,5 [26]. 1 мМ ФМСФ иПХМБ ингибируют фермент на 100 %, иодоацетамид подавляет активностьна40%ГЭМЯК(специфическийингибиторкарбоксипептидазыЕ),хелатирующие вещества (ЭДТА), агенты на сульфгидрильные группы (Nэтилмалеимид), а также соли Co2+ не влияют на активность фермента.24Активность фермента стабилизируется NaCl при отклонениях величины рНот оптимума [20].Физико-химическиесвойствамФМСФ-ингибируемойкарбоксипептидазы идентичны лизосомальной карбоксипептидазе А (КФ3.4.16.1), но значительно отличается от нее распределением активности втканях и субстратной специфичностью [35, 100, 175, 254].Распределении активности ФМСФ-КП в органах и тканях изучено унескольких видов млекопитающих [20, 18, 71, 23].
Максимальная активностьданного фермента найдена в надпочечниках, значительно ниже – в гипофизе,селезенке, легких, почках, семенниках, печени. Существенным является тотфакт, что в надпочечниках, где образуется и депонируется значительноеколичество энкефалинов, активность данной карбоксипептидазына напорядок выше, чем активность карбоксипептидазы Е. Более того, сродствоФМСФ-КП к дансил-фен-лей-арг во много раз выше, чем у КПЕ [23]. Этифакты позволяют предположить, что наиболее подходящими субстратами invivo для данного фермента являются предшественники энкефалинов(энкефалин- лей5(мет5)-арг6).Большое количество имеющихся к настоящему времени данныхпозволяютпредположитьучастиеФМСФ-КПвпроцессингеряданейропептидов [16, 35, 71].
Имеется большое количество экспериментальныхданных о вовлечении фермента в регуляцию онтогенеза [18, 22], половогосозревания [71, 23], развитие стресс-реакций [35]. Активность ФМСФ-КПменяетсяпривведениилабораторнымживотнымразличныхфармакологических агентов [65, 66, 63], растворов этанола [22, 23], половыхстероидных гормонов и глюкокортикоидов [29].
Таким образом, можносделать вывод, что ФМСФ-КП представляет собой фермент с достаточношироким спектром физиологической активности, однако, в отличие отдругих ферментов обмена регуляторных белков и пептидов, ее биологическаяроль описана недостаточно полно.251.2.3. Аминопептидазы1.2.3.1.
ЛейциламинопептидазаЛейциламинопептидаза (ЛАП, лейцинаминопептидаза, аминопептидазаI-III, аминопептидаза S, КФ 3.4.11.1) представляет собой фермент с оченьширокой субстратной специфичностью, который способен отщеплять любыеаминокислоты, кроме аргинина и лизина с N-конца пептидов [163].
Поданным Fraticante [144] и Хрусталевой [163] фермент имеет молекулярнуюмассу приблизительно 62000, по данным Gibson [163] – 270000, по даннымShimamura [268] – 53000, что указывает на возможность существованиясложнойчетвертичнойструктурымолекулы.Вактивномцентреаминопептидалы находится ион Zn2+, фермент проявляет максимальнуюактивность при величине pH 7,0-7,4. In vitro лейцинаминопептидазаактивируетсяионамиMn2+,ингибируетсябестатином,амастатиномиПХМФС, при этомарфаменин A и пуромицин не влияют на его активность[163, 262, 268]. Фермент катализирует отщепление тирозина от субстрататир-гли-гли, тир-гли-гли-фен, лей-энкефалина, динорфина-(1-8), динорфина(1-10) и динорфина-(1-13), что указывает на его сродство к группе опиодныхпептидов.
Максимальная скорость гидролиза наблюдается улей-энкефалина,при увеличении длины пептидной цепи скорость гидролиза субстрата резкоснижается, что охарактеризовано для всех экзопептидаз [163, 224, 268].Фермент широко экспрессируется во всех отделах нервной системы [163],где он обнаружен и в растворимой и в мембранной фракциях головного испинного мозга [224, 163, 268], при этом особенно высокая активностьобнаружена в миелине [268]. На сегодняшний день активность ферментаобнаружена практически во всех тканях организма [200], отмечаетсядостаточно высокая активность в плазме крови [200].
На основанииполученных экспериментальных данных можно предположить, что ЛАП26принадлежит важная роль в деградации активных форм энкефалинов [200,163, 268].1.2.4. Кислые протеазы. Катепсин DКислымпротеазам(аспартильныелизосомальныепротеиназы)принадлежит чрезвычайно важная роль в широком спектре физиологическихпроцессов, таких как пищеварение, утилизации белков, преобразованиегормонов и регуляторных пептидов [99]. Предполагается также участиекатепсина D в реакциях ограниченного протеолиза [289].Аспартильные протеиназы в большинстве систем классификациисгруппированы в 16 различных семейств на основе их аминокислотныхпоследовательностей. В свою очередь они собраны в шесть различныхкланов, основанных на их эволюционных отношениях и третичной структуре[223]. MEROPS содержит полный список всех последовательностей,имеющих отношение к семейству AP.
Большинство ферментов имеютмаксимум активности в кислом pH (3–4), а изоэлектрические точки находятсяв диапазоне pH 3–4,5. Их молекулярные массы находятся в диапазоне 30-45кДа [301].Эукариотические аспартильные протеиназы объединяет их главнаяособенность – они содержат триаду Asp-Thr-Gly вокруг двух аспарагиновыхкислот в активном центре (D32 и D215) [143]. Хотя эта характерная чертаобъединяет, аспартильные протеиназы разнообразны по многим параметрам,включаяформуактивногоцентра иклеточнуюлокализацию.Этиособенности указывают на их разные физиологические функции [143],включая внеклеточный гидролиз белков в кислом pH, перевариваниевнутриклеточных белков и активацию проферментов.Данная группа ферментов включает в себя семейства эволюционноблизко родственных протеаз – семейство пепсина, к которому принадлежат27как все пепсины и химозины животных, так и гораздо более сложный вструктурном плане катепсин D.После пепсина катепсин D – вторая наиболее изученная аспарагиноваяпротеиназа.ФизиологическиефункциикатепсинаDвключаютвнутриклеточный гидролиз белка [177], активацию некоторых проферментов[177],регуляциюапоптоза[234],игидролизпищевыхбелковубеспозвоночных [289].
Катепсин D функционирует в кислотном диапазонеpH [218]. Его структура может содержать маннозный олигосахарид,связанный в так называемомые N-месте полипептидной цепи.Для перехода в активную форму должны произойти некоторыепосттрансляционные модификации, сначала в ЭПС удаляются сигнальныепоследовательности ~20 аминокислот, в результате образуется зимоген.Затем 44 аминокислоты пропептида формируют из зимогена формупромежуточного звена, далее он будет обработан в так называемом «регионеобработки» и затем преобразован в активную двухцепочечную протеиназу[285].В катепсине D последовательности аминокислот вокруг активногоцентра и положение остатков цистеина достаточно консервативны. Две петлиокружают активный центр и они, вероятно, отвечают за узнавание субстрата.Одна из них, петля полипролина содержит три последовательных пролина,другая петля, “створка Y75” (Tyr75 от нумерации свиного пепсина) гибкая ичастично перекрывает активный центр [276].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
