Диссертация (1154746), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Поэтому КПЕ-ΔN может служить прогностическим биомаркером дляпрогнозирования протекания болезни у пациентов с раком.Повышение активности КПЕ в опухолевой ткани человека былоотмечено при инсулиномах, опухолях гипофиза, при мелкоклеточном ракелегкого, усиление экспрессии КПЕ-ΔN – при гепатоцеллюлярной карциноме,параганглиоме и феохромобластоме.51Таким образом, дальнейшее изучение активности КПЕ в опухолевойткани человека при других онкологических заболеваниях, а также изучениеэкспрессии других ферментов обмена регуляторных пептидов, в частностималоизученного фермента ФМСФ-КП, является актуальным для пониманиямеханизмов канцерогенеза и разработки методов диагностики и лечениярака.52Глава II.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ2.1. Материал и условия проведения исследованийАктивностьферментовопределяливдоброкачественныхизлокачественных новообразованиях, а также в прилегающих здоровых тканяхмолочной железы, желудка, кишечника, почек печени и легких человека,удаленных в ходе хирургических операций в ГБУЗ Пензенский областнойонкологический диспансер. Изучение активности ферментов было проведеноу 160 человек в возрасте от 35 до 70 лет. Новообразования классифицировалив соответствии с клиническими признаками и результатами гистологическогоанализа.
Были сформированы следующие группы образцов:1)ткани кишечника без патологических изменений(n=11);2) ткани желудка без патологических изменений(n=11);3) ткани молочной железы без патологических изменений(n=11);4) ткани почек без патологических изменений(n=11);5) ткани печени без патологических изменений(n=11);6) ткани легких без патологических изменений(n=11);7) полипы толстойкишки (n=12);8) полипы желудка(n=11);9) фиброкистозная мастопатия молочной железы(n=12);10) аденомы почек(n=12);11) фиброма печени(n=11);12) фиброма легких(n=11);13) аденокарцинома толстой кишки (n=14);14) аденокарцинома желудка(n=11);15) протоковая карцинома молочной железы(n=15);16) почечноклеточный рак почек(n=11);17) аденокарцинома печени(n=13);18) аденокарцинома легких (n=11).53Пробы замораживали и хранили при - 40° С для последующего анализа.Дляопределенияактивностинелизосомальныхпептидгидролазобразцы ткани были гомогенизированы в 50 мМ натрий ацетатном буфере,содержащем 50 мМ хлорид натрия, рН 5,6, в соотношении 1 : 50 (масса :объем), для определения активности кислых протеаз и катепсина D – в 100мМ натрий ацетатном буфере, рН 4,0.2.2.
Методы исследования2.2.1. Определение активности карбоксипептидазы ЕАктивность КПЕ определяли флуориметрически модифицированнымметодом Fricker и Snyder [154]. 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл(в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6,содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольнойпробы). Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚ С.
Реакцию начиналиприбавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚ С 210 мкМ растворадансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация вреакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С.Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливалипо 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с.Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10минут при 1000об/мин.Флуоресценциюхлороформнойфазыизмерялинафлуориметрефлюорат АБЛФ-Т при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см.
Дляприготовлениястандартовиспользовалираствордансил-фен-алавхлороформе.Активность фермента определяли как разность прироста флуоресценциив пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль54дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мгбелка.2.2.2.Определениеактивностифенилметилсульфонилфторид-ингибируемай карбоксипептидазыАктивностьФМСФ-КПопределялифлуориметрически[35]сиспользованием дансил-фен-лей-арг в качестве субстрата. В контрольныепробы вносили 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50мМ NaCl, pH 5,6, 50 мкл препарата фермента и 10 мкл 25 мМ ФМСФ,приготовленного на этаноле.
ФМСФ вносили в реакционную смесь послевнесения препарата фермента. Опытные пробы содержали 150 мклуказанного буфера и 50 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8мин при 37oC, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37oC 210мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробыобрабатывали как описано для КПЕ. Для приготовления стандартовиспользовали раствор дансил-фен-лей в хлороформе.Активность фермента определяли как разницу прироста флуоресценциив пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ, и выражали в нмоль дансилфен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.2.2.3. Определение активности пептидил-дипептидазы ААктивностьПДАопределялипоотщеплениюGly-Argоткарбоксибензоил-Gly-Gly-Arg при рН=8,2, с использованием каптоприла вкачестве ингибитора [211].Опытные пробы содержали 40 мкл гомогената и 20 мкл 100 мМ трисHCl.
Контрольные пробы содержали каптоприл в конечной концентрации 10мкМ. Пробы инкубировали 8 мин при 37ºС, затем вносили по 10 мклкарбоксибензоил-Gly-Gly-Arg (концентрация в пробе 3.65 мкМ) в том же55буфере. Пробы инкубировали 120 мин при 37ºС. Реакцию останавливалиприбавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Осадокотделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000 об/мин. Затемотбирали по 50 мкл надосадочной жидкости, активность ферментаопределяли нингидриновым методом [211] как разницу прироста оптическойплотности в пробах, не содержащих и содержащих каптоприл. Дляприготовления стандартов использовали раствор аргинина в 100 мМ трисHCl буфере, рН 7,6.
Активность фермента выражали в нмоль продукта врасчете на 1 мин инкубации и 1 мг белка.2.2.4. Определение активности лейцин-аминопептидазыДля определения активности ЛАП к 90 мкл гомогенатадобавляли 10 мклраствора пуромицина, приготовленного на рабочем буфере (в случаеопытной пробы) и 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4 (в случаеконтрольной пробы). Преинкубировали 8 мин при 37˚С.
Реакцию начиналиприбавлением100мкл310мкМрастворалей-β-нафтиламина,приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливалиприбавлением 40 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробыцентрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин, отбирали 100 мкл надосадочнойжидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2).Определялифлуоресценциюобразовавшегосяβ-нафтиламинанафлюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1см.
Активность фермента определяли по разнице прироста флуоресценции впробах, не содержащих и содержащих пуромицин, и выражали в нмоль βнафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мгбелка.562.2.5. Определение активности кислых протеаз и катепсина DАктивностькислыхпротеазикатепсинаDопределялифотоэлектроколориметрическим методом с использованием гемоглобина вкачестве субстрата и пепстатина А в качестве ингибитора.Навеску ткани 300 мг гомогенизировали в 3 мл 100 мМ натрийацетатном буфере с рН 4,5, на холоде. В опытные и контрольные пробывносили 120 мкл буфера, а в пробы с ингибитором внесли 110 мкл буфера и10 мкл ингибитора.
Во все пробы добавили по 40 мкл гомогената иинкубировали их на термостате при 37˚С в течении 8 минут. Затем в опытныеи в пробы с ингибитором добавили по 40 мкл раствора гемоглобина иповторно инкубировали все пробы в течении 40 мин при 37˚С. Реакциюостанавливали прибавлением 200 мкл 5% раствора ТХУ, затем прибавили вконтрольные пробы по 40 мкл раствора гемоглобина и центрифугировали всепробы при 4000 об/мин в течение 30 мин. Количество низкомолекулярныхпродуктов гидролиза было определено методом Lowry в надосадочнойжидкости.2.2.6. Метод определения белкаКонцентрацию белка в гомогенатах образцов определяли по Lowry.Дляопределения концентрации в три пробирки наливали по 0,5 мл разведенногораствора белка, в каждую из трех пробирок и в контроль (0,5 мл дист.
воды)приливали по 1 мл реактива С (свежеприготовленного из 1 мл реактива А(0,5 гCuSO4·5H2O + 1 г цитрата Na на 100 мл воды) и 50 мл реактива В (4 гNaOH + 54 г Na2CO3·10H2O (или 20 г Na2CO3) на литр воды)), перемешивалии выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 0,1мл реактива Фолин-Чикольтеу и выдерживали 40 мин при комнатнойтемпературе.
Измерялиоптическую плотность при λ=750 нм в кювететолщиной 1 см против контроля.572.2.7. Методы статистической обработкиПроверка принадлежности распределения признаков к нормальномупроизводилась по критерию хи-квадрат. Достоверность отличий междусредними величинами определяли с использованием t-критерия Стьюдента имногофакторногодисперсионногопроводилиметодомКорреляционныйШеффеанализванализа.Постдисперсионныйпорядкесравненияпроводиликоэффициента корреляции Пирсона.санализНьюмена-Кейлса.использованиемлинейного58Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕВ результате исследований было установлено, что активность всехисследованных ферментов в доброкачественных новообразованиях всехисследованных тканей была выше по сравнению с нормальными тканями(рис1-6).Приэтомдлявсехферментовотмечаетсяутрататканеспецифического паттерна активности, свойственного здоровым тканям.По-видимому, повышение активности всех пептидгидролаз – процессинга,модификации и деградации регуляторных белков и пептидов до одногоуровня характерно для всех тканей с измененным типом роста ихарактеризующимся повышенным уровнем обмена пептидных молекул.Интересно отметить тканевое распределение активности ФМСФ-КП,впервые описанное в нашей работе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
