Диссертация (1154746), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Механизм сверхэкспрессии не связан с амплификацией гена илискрупнымихромосомнымиперестройками.Врядеклетокдоброкачественной опухоли молочной железы, как эстроген так и факторыроста стимулируют экспрессию катепсина D и уровень накопления мРНК[290,280].Эстрогенчувствительныеэлементыбылинайденывпроксимальной промоторной части гена и в сочетании с другимирегуляторнымипоследовательностями(SP1,AP1),онимогутбытьответственны за стимуляцию экспрессии гена катепсина D [280, 135].Непосредственная роль катепсина D в метастазах рака была доказана наопухолевых клетках крыс, в которых сверхэкспрессия катепсина D,вызванная трансфекцией, увеличила их метастатический потенциал invivo[192].
Механизм, ответственный за метастазирование опухоли в крысиноймодели показал положительный эффект на клеточную пролиферацию впользу роста микро-метастазов, а не увеличения инвазивного потенциала[192, 280]. Использование антисмысловой РНК показало, что уровенькатепсина D является фактором, ограничивающим рост канцерогенеза ираспространение клеток MDA-MB-231 рака молочной железы в легкие [277].Врядеработбылопоказано,чтокатепсинDстимулируетпролиферацию раковых клеток. Очищенный про-катепсин D из MCF-7клеток рака молочной железы стимулировал рост клеток в MCF-7 клеткахмолочной железы [205].
Кроме того, трансфекция кДНК человеческогоКатепсина D в 3Y1-AD12 раковые клетки крыс привели к увеличенномуросту раковых клеток, как при низких, так и при высоких плотностях клетокinvivo, и показали повышенный экспериментальный метастатический46потенциал in vivo [302]. Кроме того, Vetvicka с коллегами сообщили, что прокатепсин D является митогеном для раковых клеток молочной железы ипростаты [288, 265].Были предложены различные механизмы отвечающие за митогенностькатепсина D. С одной стороны, было предложено, что его действие вкачестве лиганда может включать либо взаимодействие М6Р фрагментовкатепсина D с рецептором M6P/IGF-2 или же взаимодействие его частей профрагмента (аминокислоты 27-44) с неизвестным рецептором клеточнойповерхности [265, 244].
Кроме того, его каталитическая активность былавовлечена в активацию факторов роста [252] или в предотвращение секрецииингибиторов роста [128]. Остается вопрос о том, может ли секретированныйпро-катепсин D активироваться внеклеточно, в достаточно кислой среде.Действительно, внеклеточный рН в опухолях, как правило, более кислый,чем в соответствующих нормальных тканях. Недавно было выявлено, чтомутировавший D23N Катепсин D лишен протеолитической активности, ноостаетсямитогеннымпредположить,что[276].Поэтомупро-катепсинDэтиможетрезультатыдействоватьпозволяютвкачествевнеклеточного связывающего белка, а не как протеаза, вызывающая прямоеиликосвенноезахватываниенеизвестнымирецепторамиклеточнойповерхности.Про-катепсин D избыточно секретируется эпителиальными клеткамирака молочной железы, являясь митогеном для раковых клеток, действуя вкачестве внеклеточного связывающего белка, возможно, вызывая прямое иликосвенное захватывание неизвестными рецепторами клеточной поверхности.Катепсин D также может способствовать развитию опухоли не толькопутем воздействия на эпителиальные участки, но и путем активации ростафибробластовчерезпаракринныйцикл,включаявзаимодействиеснеизвестными рецепторами клеточной поверхности.
В этих условиях прокатепсин D сверхэкспрессируется и выделяется в больших количествахраковыми клетками, зафиксированными стромальными клетками invivo и47может способствовать не только пролиферации, но и выживанию, а такжеможетстимулироватьследовательно,подвижностьповыситьиопухолевойинвазиюфибробластови,гомеостаз.Про-катепсинD,выделяемый раковыми клетками может стимулировать ангиогенез, действуячерез паракринные петли в виде белка лиганда, вызывая прямое иликосвенное связывание с неизвестными рецепторами клеточной поверхности,которые могут присутствовать как на раковых фибробластах, так и наэндотелиальных клетках.Функция катепсина D в апоптозе еще не полностью понятна и нуждаетсяв дальнейшем изучении.
Катепсин D может либо предотвращать апоптоз, какописано в нокаут-экспериментах над мышами [206, 234] в физиологическихусловиях,либоможетспособствоватьапоптозу,вызванномуцитотоксичными агентами [284, 245]. Эта двойственность роли катепсина D вапоптозевызванатрансфицированныхпротиворечивымиклеткахрезультатами,3Y1-AD12.Ранееполученныминабылопоказано,чтосвехэкспрессия катепсина D предотвращала апоптоз опухоли, таким образом,взависимостиотегокаталитическойфункциивкатепсинDтрансфицировали ксенотрансплантаты 3Y1-AD12. Проведенные работы стеми же рядами клеток, обработанных химиотерапевтическими агентами,указывали на стимуляцию апоптоза в независимости от каталитическойактивности катепсина D.
Похоже, таким образом, в зависимости от условийокружающейсреды,катепсинDможетлибоингибировать,либостимулировать апоптоз, посредством различных механизмов. Можно сделатьвывод, что данная протеаза участвует более чем в одном пути апоптоза.Катепсин D был обнаружен в качестве ключевого медиатора апоптоза, вряду с другими агентами, вызывающими апоптоз, такими, как: IFN- гамма ,FAS/APO , TNF-альфа, окислительный стресс, адриамицин и этопозид,цисплатин и 5-фторурацил а также стауроспорин.
Участие катепсина D вапоптозе также связывают с высвобождением фермента с молекулярноймассой 34 кДа из лизосом в цитозоль, что приводит в свою очередь к48высвобождению цитохрома С из митохондрий в цитозоль [73], активациипро-каспазы-9 и -, расщеплении Bidinvitro при рН 6,2, или активации Bax,независимо от расщепления Bid [176].По мере развития апоптоза, зрелый лизосомальный катепсин D быстровысвобождается из лизосомы в цитозоль, что приводит к высвобождениюцитохрома С в цитозоль и активации каспазы-9 после связывания с Apaf-1(апоптоз-инициирующегобелка)иактивациикаспазы-3.Механизмопосредствования катепсина D в апоптозе остается неизвестным.
Возможнымспособом влияния катепсина D может быть укорачивание Bid в tBid вцитозоле. tBid может вызвать образование активной конформации Вах вцитозоле при непосредственном взаимодействии tBid/Bax, позволяя вставитьBaxвовнешнююмитохондриальнуюмембрануспоследующимвысвобождением цитохрома С [226]. Кроме того, Катепсин D можетпотребоваться для Bid-независимых путей для высвобождения Вахопосредованной AIF (апоптоз-индуцируемого фактора) из митохондрий вцитоплазму, и в ядро, что в свою очередь вызывает ремоделированиехроматина в начале каспаза-независимого апоптоза [226].Многочисленные исследования показали, что пепстатин А являетсяингибитором аспартатовых протеаз и может частично задержать апоптоз,вызванныйIFN-гаммой,FAS/APO,TNF-альфой,стауроспорином,окислительным стрессом, при микро-инъекции пепстатина А. Отсюда можноделать вывод, что катепсин D играет ключевую роль в апоптозе,опосредованный через его каталитическую активность.Тем не менее, катепсин D является одним из лизосомальных ферментов,который требует более кислую рН, чтобы быть протеолитически активнымпо отношению к цистеиновым лизосомальным ферментам, таким каккатепсины B и L.
Подкисление в цитозоле вплоть до значений рН около 6.7является хорошо изученным явлением апоптоза. Однако катепсин D можетрасщеплять свои субстраты invitro в пределах рН до 6,2, но не выше.Следовательно, можно предсказать, что протеолитическая активность49цитозольного катепсина D будет резко ухудшается при неблагоприятныхзначенияхрН. Поэтому остается открытым вопрос о том, способен ликатепсинDрасщеплятьцитозольныйсубстрат,причастныйкапоптотическому каскаду.
Обработка этопозидом, доксорубицином, TNFальфой или анти-CD95 предотвращала гибель клеток [214]. Кроме того,пепстатин А не подавлял расщепление Bid, или активацию про-каспазы-9 и-3 при фотодинамической терапии в клетках гепатомы мышей [166].Высокая активность КПЕ была обнаружена в (нервно) эндокринныхопухолях,такихкакинсулиномы,опухолигипофиза,вклеткахмелкоклеточного рака легкого [194]. Усиленная экспрессия КПЕ в этихопухолях опосредована, поскольку данный фермент необходим длябиосинтезарегуляторныхпептидов,которыеслужатаутокриннымифакторами роста в этих опухолях [215].Экспрессия особой изоформы КПЕ - КПЕ-ΔN – была обнаружена LeeTK, Murthy SR и др. в клеточных линиях, полученных из печени, толстойкишки, молочной железы [304].Эта же изоформа была обнаружена в клетках метастаз человека.
Быловысказано предположение, что КПЕ-ΔN способствует пролиферации иинвазии раковых клеток. Иммуногистохимическое исследование показало,что КПЕ-ΔN может проявлять ферментативную активность в ядре клетки.ПоследующиеисследованияподтвердиливзаимодействиеКПЕ-ΔNсдеацетилазами гистонов (К.Ф. 3.5.1) 1 и 2, которые, модифицируягистоныиизменяяконформациюхроматина,играютважнуюрольврегуляцииэкспрессии генов.Также показано, чтоКПЕ-ΔN увеличивает уровень экспрессииизвестного гена Nedd9.
Механизм действия NEDD9 хорошо описан [304,211]. Повышенная экспрессия гена Nedd9 в норме наблюдается во времяэмбрионального развития и подавляется во взрослом организме.50Есть экспериментальные доказательства того, что экспрессия гена Nedd9у взрослой особи вызывает развитие рака, способствует делению опухолевыхклеток и стимулирует их инвазивность [211].Для установления роли КПЕ-ΔN была создана модель на животных: 1-ойгруппе мышей были подкожно имплантированы метастазирующие клеткимыши, 2-ой группе имплантировали метастазирующие клетки мыши,предварительно обработанные siRNA, блокирующими синтез КПЕ-ΔN.У 2-ой группы мышей, которым были имплантированы опухоли,обработанные антисмысловыми РНК, блокирующие синтезКПЕ-ΔN,существенно замедлился рост и распространение опухоли.Кроме того, Lee, Murthy и др., проведя исследование на опухолевойткани человека, удаленной после хирургического вмешательства, показали,что:1)УровеньКПЕ-ΔNвопухолевойтканичеловекапригепатоцеллюлярной карциноме, параганглиоме и феохромобластоме былповышен по сравнению с окружающими здоровыми тканями;2) Чем больше была разница между содержанием КПЕ-ΔN в опухолевыхи здоровых тканях, тем больше была инвазивность опухоли.
(Уровеньэкспрессии КПЕ-ΔN соотносили с дальнейшим течением заболевания,контролируемым в течение нескольких лет). В здоровых клетках содержаниеКПЕ-ΔN минимально.Эти результаты показывают, что КПЕ-ΔN способствует инвазии ипролиферации опухолевых клеток exvivoи метастазирующих клеток вinvivo.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
