Диссертация (1154746), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Висследовании функциональной роли нелизосомальных протеолитическихферментов в последнее время достигнуты большие успехи. Сформированныйнами обзор по наиболее исследованным представителям данной группыферментов,являетсясвидетельствомбольшоеговниманиякнелизосомальным пептидгидролазам, но тем не менее это лишь начальныеэтапы в выяснении их функциональной роли.171.2.1. Дипептидилкарбоксипептидазы1.2.1.1. Пептидил-дипептидаза ААнгиотензинпревращающий фермент пептидил-дипептидаза А (ПДА)имеет ярко выраженные признаки пептидилдипептидазы, а также слабыетрипептидилкарбоксипептидазную и эндопептидазную активность [187].Фермент получен из тканей различных видов животных [51]. В тканяхмлекопитающих ПДА присутствует в соматической и тестикулярноймолекулярной форме, которые различаются по физико-химическим ииммунологическим свойствам.В состав эндотелиальной формы входят неидентичные каталитическиеС- и N-домены.
В каждом из данных доменов находится активный центр ицентр связывания Zn2+ с общей молекулярной массой 150-180 кДа [83]. Длятестикулярной формы с Mr 90-100 кДа характерно наличие одиночнойполипептидной цепи и соответствие С-домену эндотелиальной формы [83].Экспрессия представленных изоэнзимов происходит их одного гена [232].Также в литературе встречается определение нейрональной формы ферментас Mr 170 кДа, отличающейся от эндотелиальной формы по степенигликозирования [91].Анализ различных источников показал, что оптимум pH среды ПДАсоставляет 7,6-8,2, однако для проявления его максимальной активностинеобходимо воздействие ионов Cl- [62].
На каждый каталитический центрмолекулы фермента приходится один ковалентно связанный ион Zn2+. ПДА взначительной степени ингибируется хелатирующими агентами - ЭДТА и офенантролином–засчетбрадикининпотенциирующегофактора,дитиотреитола, 2-меркаптоэтанола и додецилсульфата натрия [188]. Такиевеществакактиорфан,бацитрацин,N-этилмалеимид,пуромицин,фосфорамидон, при этом ГЭМЯК – специфичный ингибитор металлзависимых основных карбоксипептидаз не влияет на активность фермента [8,18123].
На основе данных исследований создан новый класс пептидныханалогов субстратов пептидил-дипептидазы А с константой ингибированияпорядка 10-50 нМ, наиболее известными из которых являются каптоприл,еналаприл, лизиноприл [127].In vitro ПДА способен катализировать процесс расщепления более 30биологически активных пептидов и их предшественников [10, 132, 271].Основные функциональные реакции это превращение ангиотензина I вангиотензин II (Km = 4-70 мкМ), поэтапное отщепление двух дипептидов сC-конца брадикинина, расщепление неокиоторфина на киоторфин (Km = 0,58мМ), мет-энкефалин-арг6-фен7 с образованием мет-энкефалина (Km = 0,30мМ).
Помимо этого, фермент осуществляет образование мет-энкефалин-арг6измет-энкефалин-арг6-гли7-лей8,способствуетпоследовательномуотщеплению двух дипептидов с C-конца динорфина A 1-8, расщеплениюнатрийуретическогофактораизмозгаипредсердий,вазопрессина,окситоцина, вещества P, вещества K, холецистокинина, нейротензина,энкефалина, нейрокинина A и B, гастрина, люлиберинабомбезина, βэндорфина, инсулина. В ряде научных публикацийпоследних летутверждается, что β-амилоидный пептид может подвергаться гидролизу припомощи N-концевого домена пептидил-дипептидазы А [57, 50, 306].Вне живого организма активность ПДА может подавляться многимибиологически активными пептидами и их предшественниками, к примеру,неокиоторфином, брадикинином, мет-энкефалин-арг6-фен7, веществом P, βлипотропином, лей-энкефалин-арг6 и небольшой группой дипептидов[10].В тканях животных и человека наблюдается широкая экспрессияфермента.
Наиболее высокое его содержание обнаружено в легких,семенниках, почках (активность ПДА ниже, чем в легких в 25 раз), плазмекрови (активность ПДА примерно в 200 раз ниже, чем в легких) [49]. Степеньактивности ПДА в мозге практически сопоставима с его активностью впочках [117]. Локализация фермента в синаптосомах объясняет его высокоесодержание в гипофизе и стриатонигральном тракте [112]. В последнем ПДА19присутствует только в нейрональной форме, поскольку связан с фракциеймембран, содержащей большое количество мускариновых рецепторов [91].Фермент активно учувствует в процессе регуляции физиологическихфункций организма, обеспечивает нормальную работу сердца, легких, почек,системную регуляцию кровотока в виду преобразования ангиотензина I вангиотензин II, являющегося выраженным вазоконстриктором, и разрушениибрадикинина,проявляющеговазодилататорныесвойства[187,207].Актуальные исследования показали, что ПДА оказывает влияние наповеденческий статус животных, путём влияния на их устойчивость кэмоционально-болевомустрессу,мотивационномуповедению,агрессивности, склонности к потреблению алкоголя, принимает участие вформировании наследственной формы гипертонии, этиологии и патогенезеболезни Альцгеймера, активно вовлекается в ответ на потребление этанола идействие холиноблокаторов [25, 38, 49, 55, 64].
Ингибиторы пептидилдипептидазы А оказывают прямое влияние на количество потребления водыи этанола, значительно усиливают обезболивающий эффектмет-энкефалинарг6-лей7 и угнетают его распад в мозге. Кроме того, каптоприл являетсяантидепрессантом, пролонгирует и усиливает анальгетические эффекты Metи Leu-энкефалинов, однако данные эффекты блокирует налоксон[70, 225].Результаты исследования дают возможность сделать вывод о наличииширокого спектра субстратной специфичности ПДА и его участии в обменебольшого количества регуляторных пептидов. Активность фермента являетсяодним из ключевых факторов, определяющих функциональное состояниевсех систем живого организма.201.2.2.
Карбоксипептидазы1.2.2.1. Карбоксипептидаза EКарбоксипептидазаЕ(КПЕ,около20летизвестнаякаккарбоксипептидаза Н, энкефалинконвертаза, КФ 3.4.17.10) была впервыеизолированаизмозгаихромаффинныхгранулнадпочечниковмлекопитающих [154]. Экспрессия данного фермента к настоящему времениустановлена во многих органах и тканях, однако ее присутствие в них можетсущественно различаться, иногда на несколько порядков и практическивсегда коррелирует с концентрацией биологически активных форм пептидови интенсивностью их обмена [170, 274].
В клетках карбоксипептидаза Еприсутствует в двух формах: растворимой с молекулярной массой 53-57 кДаи связанной с мембранами (Mr 55-57 кДа). И та и другая формыпредставляютсобойодноцепочечныегликопротеины,которыетранскрибируются из одного гена. Связанная с мембранами форма ферментаотличается от растворимой формы наличием С-концевой аминокислотнойпоследовательности из 21 остатка аминокислот [222]. При изменениивеличины рН в щелочную сторону мембранная форма фермента переходит врастворимую [153, 171]. КПЕ синтезируется на рибосомах в виденеактивного зимогена с молекулярной массой 75000 [230].
Предшественникферментапревращаетсявактивнуюформудействиемнаборатрипсиноподобных протеаз внутри секреторных везикул [139]. Неактивнаяформа с Mr 65000 образуется первой [185], далее она переходит в активныеформы в результате ограниченного протеолиза [139, 246]. Каталитическаяактивность солюбилизированной формы фермента в пересчете на однумолекулу выше, чем у мембраной формы.
Процентное сотношение междуразными формами фермента меняется в процессе созревания секреторныхвезикул [152].21Можно предполагать, что мембрансвязанная форма карбоксипептидазыЕ ассоциирована смембранами эндоплазматическогоретикулумаиповерхностными элементами аппарата Гольджи, в то время как растворимаяформа фермента – с содержимым секреторных везикул [170], причем ихсоотношение данных форм как правило отличается в различных типахклеток. Совместная локализация солюбилизированной формы фермента сбиологически активными пептидами – энкефалинами, β-эндорфином, АКТГ,окситоцином,вазопрессином,инсулином,глюкагоном,атриальнымнатрийуретическим фактором и веществом P наблюдается в секреторныхгранулах многих клеток [147, 185, 114, 258, 274, 170].КПЕ имеет исключительную специфичность ко всем субстратампептидной природы с остатками основных аминокислот на С-концемолекулы.
Фермент отщепляет остатки аргинина от арг8-вазопрессин-глилиз-арг [258], а также превращаетэнкефалин-лиз6 в125125I-мет-энкефалин-арг6 и125I-мет-I-мет-энкефалин [184]. Карбоксипептидаза Е отщепляетостаткок -лиз15-лиз16-арг17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ врезультате поэтапных действий, а также остаток аргинина с карбоксильногоконца гиппурил-L-арг и лей-энкефалин-арг [184]. Кроме того, фермент можетотщеплять остаток гистидина с С-конца проокситоцина (с очень низкимсродством) [272].КПЕ представляет собой типичный тиолзависимый металлофермент,активный центр которого содержит Zn2+ [155]. Данная карбоксипептидазаимеет рН оптимум 5,5-6,0, активируется ионами Ni2+ в 2-3 раза, ионами Co2+в 5-10 раз, ингибируется аминопропилмеркаптоянтарной кислотой, 2меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ПХМФС, CuCl2,HgCl2, ЭДТА и 1,10-фенантролином. N-этилмалеимид, ФМСФ, хлоридкальция и сульфат цинка не влияют на активность фермента [153, 278].ГЭМЯК и гуанидинопропилянтарная кислота представляют собой наиболееэффективные ингибиторы карбоксипептидазы Е с Ki 8,8 нМ и 7,5 нМ,соответственно [155].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
