Диссертация (1154746), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Активность ферментов оценивали спектрофотометрическими ифлуориметрическими методами с использованием специфических субстратови ингибиторов. Статистическая обработка результатов проводилась с9помощью программного обеспечения Microsoft Excel 10.Положения, выносимые на защиту:1.протеаз,Активности ферментов обмена регуляторных пептидов - кислыхкатепсинаD,карбоксипептидазыE,ФМСФ-ингибируемойкарбоксипептидазы, пептидил-дипептидазы А, лейцинаминопептидазы вдоброкачественных опухолях молочной железы, желудка, кишечника, почек,печени и легких человека существенно повышаются по сравнению создоровыми тканями, что сопровождается утратой тканеспецифическогопаттерна в распределении активности протеолитических ферментов.2.Развитиевпротоковойкарциномемолочнойжелезы,почечноклеточном раке, аденокарциноме желудка и толстой кишкисопровождаетсязначительнымкарбоксипептидаз–ростомкарбоксипептидазыактивностиEиосновныхФМСФ-ингибируемойкарбоксипептидазы, в то время как не только в здоровых, органах, но и вдоброкачественныхновообразованияхактивностьданныхферментовсущественно ниже.3.катепсинаВысокий рост активностей и усиление корреляционных связейD,карбоксипептидазыкарбоксипептидазыE,ФМСФ-ингибируемойсвидетельствуют о важной роли этих ферментов вмеханизме развития злокачественных новообразований.Степень достоверностиДостоверность результатов исследования подтверждается объемомфактического материала (160 обследованных пациентов), применениемсовременных методик определения активности ферментов и использованиемметодов статистической обработки данных, полностью соответствующихпоставленным задачам.10Апробация работыМатериалы диссертации были представлены на 6 Международных иВсероссийских конференциях и съездах: Фундаментальные и прикладные исследования в современной науке:Международная научно-практической конференция, посвященная 70-летиюПобеды в Великой Отечественной войне, Пенза, 2015 Российская наука в современном мире: Международная научнопрактическая конференция, Москва, 2015 Наука и современность – 2014: Международная научно-практическаяконференция, Майкоп, 2014 Биология – наука XXI века: 18-ая Пущинская международная школаконференция молодых ученых, Пущино, 2014 Культурное и историческое наследие в образовании и науке: IXМеждународная научно-методическая конференция, Пенза, 2013 V Всероссийский с международным участием медико-биологическийКонгресс молодых учёных «Симбиоз-Россия 2012», Тверь, 2012Публикация результатов исследованияПо теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 врецензируемых журналах, рекомендованных ВАК министерства образованияи науки РФ для публикации результатов диссертационных исследований.Структура и объём работыДиссертация представлена на 131 страницах текста, состоит изследующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов иметодов, результаты исследования и их обсуждение, заключение, списоклитературы, который включает в себя 14 рисунков, 17 таблиц ибиблиографический список, содержащий 307 источников, из них 71отечественных и 236 зарубежных.11Личный вклад автораАвторомличновыполнялисьрегистрацияобразцовнаместехирургического извлечения, лабораторное определение активности всехисследованных ферментов, осуществлялись статистическая обработка ианализ результатов исследования.12Глава I.
ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ ИПЕПТИДОВРегуляторные пептиды – чрезвычайно обширная группа физиологическиактивных веществ, оказывающих сильное влияние почти на все процессы,протекающие в живых организмах. Этот класс молекул объединяетнесколько групп веществ, значительно различающихся по химическойформуле, локализации в организме и осуществляемым функциям, чтосущественно усложняет попытки создания единой системы классификациинейропептидов. Регуляторные пептиды по своей химической структурепредставляютсобойотносительнонебольшиецепочкиизостатковаминокислот. Данные молекулы образуются в организме под действиемферментовпротеолизаиззначительноболеекрупныхмолекул-предшественников [31, 40, 45, 123, 164, 150, 152, 263].
Имеется большоеколичество экспериментальных данных, которые формируют представленияо том, что неразрывной частью пептидергической системы является большойкласс регуляторных белков, принимающих участие не только в контролесоматических функций, но и осуществляющих регуляцию большогоколичества высших функций ЦНС [146, 250, 291, 161, 279, 305].Протеолитические ферменты (протеазы, пептидгидролазы, пептидазы) –достаточно большая группа биологических катализаторов, которая относитсяк 3 классу, 4 подклассу (К.Ф.
3.4.) в соответствии с общепринятойклассификацией. Протеазы катализируют реакции расщепления пептидныхсвязейвмолекулахполипептидов.Протеолитическиеферментыклассифицируют по совокупности признаков: по специфичности действия(субстратной специфичности), по организации каталитического центраферментативной молекулы и по механизму действия на белки (экзо- иэндопептидазы). В последнее время общепринятым является представление отом,чтопептидазыфизиологическихопосредованнопроцесов,лежащимосуществляютвосноверегуляциюмеханизмов13функционирования нервной системы, а также вовлекаются в регуляциюпроцессов роста и дифференцировки тканей организма человека и животных[1, 45, 99, 35].1.1.Энзимологическиеосновыобразования,модификацииидеградации регуляторных пептидовИсточником чрезвычайно высокого разнообразия ключевых молекулпептидергической системы является комплексная работа молекулярныхсистем альтернативного сплайсинга молекул пре-мРНК и последовательногоограниченного протеолиза полипептидных предшественников, которые всвоей структуре имеют последовательности сразу нескольких регуляторныхпептидных молекул [35, 253, 147, 148].
Именно процессам ограниченногопротеолизаотводятпервостепеннуюроль,посколькуконцентрациябиологически активных форм пептидов опосредуется соотношением междускоростями их образования и распада.Регуляторные белки и предшественники пептидов синтезируются нарибосомахзернистогоэндоплазматическогоретикулумаввидевысокомолекулярных неактивных препропептидов [125, 231]. Типичнымипредставителями являются: проопиомеланокортин, препроэнкефалин А,препроэнкефалин В, предшественник гонадотропин-рилизинг-фактора [253].В различных видах тканей из одного и того же полипептидногопредшественника образуютсяразные активные формы пептидов [59]. Так ваденогипофизе из молекулы проопиомеланокортина получаются в основномАКТГ, β-липотропин и β-эндорфин.
В средней доле гипофиза онирасщепляются далее с образованием α-МСГ и фрагментов β-эндорфина [253].По-видимому, подобная тканеспецифичность может быть связана с разнойкомбинацией ферментов в разнличных тканях и/или с разными путямирегуляции каталитической активности.14НамолекулN-концепре-пропептидовнаходитсясигнальнаяпоследовательность из приблизительно 20 аминокислотных остатков,которая определяет пути сортировки новосинтезированной молекулымеханизмомеевзаимодействиясоспецифическимирецепторамиэндоплазматического ретикулума и транспортировки предшественникарегуляторной молекулы в канал ретикулума [263]. После отщеплениясигнальнойпоследовательностипроисходитформированиеконечнойтретичной структуры полипептидной молекулы путём осуществленияковалентноймодификациисульфирования–фосфорилирования,илиамидирования.Данныеацетилирования,преобразованиязащищаютмолекулу в ходе следующих этапов протеолитического процессинга,который продолжается до формирования биологически активных формпептидов [15, 147].
Реакции эндо - и экзопротеолиза, происходящие в ходероцессинга активных форм пептидов, осуществляется при транспортировкемолекул предшественников по просвету эндоплазматического ретикулума,каналлам комплекса Гольджи и в секреторных везикулах, где содержитсянеобходимое соотношение различных протеолитических ферментов, а такжесистемы поддержания постоянного значения pH внутри везикул [159].Эндопротеолизпептидноймолекулыосуществляетсятрипсиноподобными протеазами (про-вазопрессин-превращающий фермент[216],проопиомеланокортин-превращающийфермент,тиоловаяпрогормонконвертаза [88], продинорфин-превращающего фермента [124],субтилизиновыхэндопептидазгруппыфурина[264],эндотелин-превращающего фермента [46]. В результате их действия, как правило,осуществляется гидролиз пропептидов по парам остатков аргинина и лизина- основных аминокислот [275].
Молекулы, образовавшиеся в результатедействия эндопептидаз, подвергаются далее экзопротеолизу аминопептидазоВ-и/иликарбоксипептидазо-В-подобнымиферментами.Приэтомпроисходит отщепление “лишних” N- или, как правило, С-концевых остатковаргинина и лизина. Заключительный этап процессинга, после которого15образуются биологически активные формы пептидов, и осуществляющие еёферменты,наиболееважныдляпониманиямеханизмоврегуляцииконцентрации регуляторных пептидов в патогенезе различных заболеваний[147, 148]Деградацияактивныхформпептидовосуществляютсяпонелизосомальному пути действием обширного набора протеолитическихферментов[242,35],хотяимеетсярядэкспериментальныхработ,свидетельствующих о том, что лизомальный протеолиз может вноситьбольшой вклад в пути обмена регуляторных пептидов, особенно приразличных функциональных расстройствах [67].1.2.Характеристикапротеолитическихферментовобменарегуляторных пептидовНелизосомальныепептидгидролазырастворимыхимембрансвязанныхобразование,модификациюилипредставленыкомплексомферментов,осуществляющихразрущениесоответствующейполипептидной молекулы в конкретном месте организма в определенноевремя.
Главной задачей данной системы, в отличие от протеолитическихферментов лизосом, осуществляющих полный гидролиз молекул доиндивидуальныхаминокислот, являетсямногоэтапное преобразованиеактивных форм регуляторных пептидов из одной в другую. Особенностисистемы протеолиза нелизосомальной локализации обусловлены множествомфакторов.Первостепеннымвременнаяразобщенностьпептидгидролаз.Протеазыфакторомвявляетсялокализациинелизосомальногопространственнаяиифункционированиипутипреимущественнонаходятся в мембрансвязанном состоянии [1, 98, 35].
Пептидгидролазы,присутствуявразличныхсубклеточныхкомпартментах,лишенывозможности одновременно расщеплять полипептид до индивидуальныхаминокислот.Пространственнаяразобщенность,такимобразом,16представляет собой эффективный фактор, сдерживающий расщеплениеполипептидов нелизосомальными пептидгидролазами и является главнымфактором, определяющим особенность их функций.Вторым основополагающим фактором является то, что в отличие отлизосом в гиалоплазме находится только 3-4 эндопептидазы, что значительноограничивает возможность их участия в основной схеме тотальногопротеолиза. Данными ферментами являются протеасома [248], кальпаин[281] и нейтральные эндопептидазы 24.15 и 24.16 [227].Крометого,специфическиесвойствацитоплазматическихпептидгидролаз по сравнению с лизосомальными, например, их высокаялабильность [227], зависимость каталитических свойств от катионовметаллов [242], органиченная субстратная специфичность по отношению кцитоплазматическим белкам и пептидам [1, 275, 147, 148] исключаетнелизосомальныепептидгидролазыотучастиявгенерализованномпротеолизе.В заключение, особенности структурно-функциональной организациинелизосомальных пептидаз в клетке, дают возможность сделать вывод опреимущественном участии этих ферментов в синтезе и преобразованиибиологически активных форм регуляторных белков и нейропептидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
