Диссертация (1154700), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Выявить зависимость показателей иммуногистохимического исследованияот гистологического варианта миомы матки.4. Разработать персонализированный алгоритм лечебно-диагностическихмероприятий у пациенток с миомой матки репродуктивного возраста, перенесшихмиомэктомию, с учетом эпигенетических детерминант.Научная новизна. Разработана и научно обоснована концепция рискаорганоуносящего лечения миомы матки с учетом эпигенетических детерминант.Введено новое понятие «эпигенетическая детерминанта возникновения ипрогредиентноготечениямиомыматки».Предложенаоригинальнаястратификация пациенток репродуктивного возраста, подвергшихся миомэктомии,наосновеиндивидуальногорискарецидивазаболевания.Доказанаперспективность использования предложенной стратификации в клиническойпрактике. Получены приоритетные данные о том, что миома матки является WNTзависимой опухолью.Теоретическая и практическая значимость.
В ходе исследованиярасширены представления о патогенезе миомы матки, углублены и дополненысуществующие сведения о закономерностях роста миоматозного узла. Впервыевыявлена взаимосвязь состояния WNT-каскада и пролиферативной активности7клеток в миоматозном узле.Установлено, что для генов рецепторов стероидных гормонов при миомематкихарактерноДНК-гипометилирование,адлягенаWIF1-ДНК-гиперметилирование.
Подтверждены существующие представления о возможномвлиянии прогестерона на рост и структурные особенности миомы матки.Разработана математическая модель прогнозирования риска возникновения ипрогредиентного течения миомы матки у пациенток репродуктивного возраста,перенесших миомэктомию.Практическому здравоохранению предложен модифицированный алгоритмлечебно-диагностических мероприятий после миомэктомии в репродуктивномвозрасте, позволяющий патогенетически обосновать индивидуальный подход квыбору тактики ведения пациенток с учетом индивидуального риска рецидивамиомы.Методология и методы исследования. Настоящее исследование выполненов период 2012–2017 гг.
на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии скурсом перинатологии медицинского факультета Медицинского институтафедеральноговысшегогосударственногообразованияавтономного«Российскийобразовательногоуниверситетдружбыучреждениянародов»(зав.кафедрой — чл.-корр. РАН, д.м.н., профессор Радзинский В.Е.) в гинекологическомотделении государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Городскаяклиническая больница имени В.В.
Виноградова Департамента здравоохраненияМосквы» (главный врач – д.м.н., профессор О.В. Шарапова).Организационно-методический подход к изучению особенностей миом маткив зависимости от эпигенетических детерминант заключался в создании программыисследования (Рисунок 1).Критерии включения: возраст пациенток от 32 до 45 лет, миома матки склиническимипроявлениями,требующаяоперативноголечения,«пролиферативный» (пролиферирующий, митотически активный) или «простой»8Рисунок 1 — Дизайн исследования9(обычный) тип морфологического строения узла [253], наличие информированногосогласия пациента на участие в исследовании.Критерии исключения: наличие наружного и внутреннего эндометриоза,гиперплазии эндометрия, предраковых заболеваний шейки матки, рака шейкиматки и рака эндометрия, наличие в анамнезе применения гормональной терапиидля лечения миомы.Ретроспективно в зависимости от морфологического строения биоптатовмиоматозных узлов все пациентки были разделены на две группы.
Первую группусоставили 79 пациенток с миомой матки с преобладанием пролиферативногокомпонента — митотически активная лейомиома по классификации ВОЗ (более 15типичных митозов в поле зрения), вторую группу составили 79 пациенток спростой миомой матки — обычная лейомиома (менее 15 типичных митозов в полезрения) [253]. Морфологический тип лейомиомы матки уточняли послеморфологическогоииммуногистохимическогоисследованияудаленныхмиоматозных узлов.Термин «пролиферирирующая» миома использовали при более плотномрасположении клеточных единиц, если при этом не наблюдали ни митотическойгиперактивности,ниочаговкоагуляционногонекроза,никлеточногополиморфизма, ни атипичных некрозов.Особенности морфо-структурного строения лейомиом позволяли выделитьтри основных разновидности лейомиомы в морфогенетическом отношении:пролиферирующиемиомы,обладающиехарактеристикамиистиннойдоброкачественной опухоли миометрия, простые лейомиомы, растущие по типудоброкачественных мышечных контролируемых гиперплазий; и, так называемые«промежуточные предсаркомы» [253].Предоперационное обследование пациенток с простой и пролиферативноймиомой матки включало обзор анамнеза с заполнением индивидуальнойрегистрационной карты пациентки, клиническое исследование, ультразвуковоеисследованиемиоматознойсдопплерометрией,тканиподвергалигистероскопию.Полученныйморфологическомуматериалисследованию,10иммуногистохимическомуисследованию,исследованиюстатусаДНК-метилирования.При заполнении регистрационных карт уточняли возраст менархе иособенностименструальнойфункции,началополовойжизни,числобеременностей и родов.
В сборе анамнеза особое внимание уделяли наличиюгинекологических и соматических заболеваний, перенесенных оперативныхвмешательств.Клиническое исследование включало общий осмотр с оценкой кожногопокрова, изучение сердечно-сосудистой, мочевыделительной, эндокринной,пищеварительной, дыхательной систем. Для оценки гинекологического статусапроизводили осмотр наружных половых органов и молочной железы, исследованиевлагалища, шейки матки при помощи гинекологических зеркал, двуручноевлагалищное исследование органов малого таза [1].ЭхографическоеультразвуковогоисследованиеаппаратаSonoscapeпациентокS20проводилистандартнымиспомощьюконвекснымитрансабдоминальными датчиками с частотой 3,5 и 7,5 МГц, а такжетрансвагинальным датчиком с частотой 5,0 МГц по общепринятой методике:определяли размеры, объем, положение, структуру шейки матки и тела матки;однородность миометрия, толщину и структура эндометрия; структуру тканияичника, его объем; наличие и объем свободной жидкости, особенностикровоснабжения.Гистероскопию выполняли всем пациенткам для уточнения состоянияполости матки и эндометрия операционным гистероскопом фирмы «Storz» (ФРГ)после обработки полости матки стерильным физиологическим раствором хлориданатрия, поступающим под давлением 50 мм рт.
ст.Гистологическому исследованию подвергали ткань миоматозных узлов.Приготовление парафиновых блоков выполняли по стандартной схеме. Окраскагистологических срезов производили гематоксилин-эозином, после чего спомощью световой микроскопии по общепринятой методике производилиморфологическое исследование.11Для иммуногистохимического исследования образцы каждого миоматозногоузла фиксировали в 10% формалине (ph=0), по стандартной методике заливали впарафиновые блоки.
Подготовленные срезы окрашивалипикрофуксиномпометодикеВан-Гизона.гематоксилином,Использовалипервичныемоноклональные антитела: к рецепторам эстрогенов (rabbit monoclonal antibody,IgG [SP1], C-term, Spring Bioscience, (USA) и к рецепторам прогестерона (rabbitmonoclonal antibody, IgG [SP2], C-term, Spring Bioscience, USA).Для визуализации связывания комплекса антиген-антитело использовалипероксидазу хрена в комплексе с субстратом перекиси водорода, а такжеколориметрический реактив (3,3-диаминобензидин). Иммуногистохимическиереакции ставили в СВЧ печи по общепринятой методике.Результаты иммуногистохимического исследования для ER α, РR B,оценивали в баллах по шкале Allred с оценкой интенсивности окрашивания исуммированием баллов количества иммуноокрашенных клеток.Число иммуноокрашенных клеток подсчитывали в баллах:0- это 0% клеток,1- это 0,1–1% клеток,2- это 2–10% клеток,3- это 11–33% клеток,4- это 34–66% клеток,5- это 67–100% клеток.Интерпретация (в баллах):0 — полное отсутствие продукта реакции/выявление его в цитоплазме иядрах ≤ 5% , экспрессия нулевая1 — выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре при фокальном идиффузном распределении, если 5 ≤ х ≤ 40%, экспрессия слабая;2 — выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре при фокальном идиффузном распределении, если 40 ≤ х ≤ 70%, экспрессия умеренная;3 — выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре при диффузномраспределении,если х ≥ 70%, экспрессия выраженная.12Прииэкспрессиистероидныхрецепторовиспользовалсяметодгистологического счета H-score:S=1а + 2b + 3с,где а — слабоокрашенные ядра,%;b — умеренноокрашенные ядра,%;с — сильноокрашенные ядра,%.Интерпретация по H-score:от 0 до 10- при нулевой рецепцииот 11 до 100- при слабой рецепцииот 101до 200- при умеренной рецепцииот 201до 300- при сильной рецепцииОценку экспрессии стероидных рецепторов проводили в ООО «Инвитро»(заведующая ЛГЦ Устинова Е.И.).Полученные образцы тканей измельчали на кусочки по 2 мкг, которые затемподвергали лизису с целью выделения ДНК и переводу неметилированныхостатков цитозина в тимин при сохранении неизменными метилированныхостатков цитозина (бисульфитной конверсии).
Для достижения данной целииспользовали набор innuCONVERT Bisulfite All-In-One Kit (Analytik Jena,Германия). Все действия выполняли согласно протоколу.Для проведения ПЦР 50 нг бисульфит-конвертированной ДНК отбирали дляпоследующей «тачдаун» ПЦР-амплификации с использованием полимеразнойсмеси GoTaq® HotStartGreenMasterMix (Promega, США) и праймеров дляамплификации участков промоторов гена WIF1 от -554 до -140 нуклеотидов достарт-кодона, участков промоторов генов ESR1 (-637 до -278 нуклеотидов до старткодона) и PRB (-484 до -93 нуклеотидов до старт-кодона), и содержащих, помимокомплементарной последовательности, универсальную последовательность M13на 5’-конце.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
