Диссертация (1154338), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Отсюда особый интерес186к фармакодинамическому анализу основных БМКК – верапамила, дилтиазема инифедипина в отношении фибробластов, прежде всего, в условиях исключающихвлияние сложных каскадов реакций на уровне организма. Тестированиелекарственных средств на клеточных культурахсогласно Российскомузаконодательству и международным нормам биоэтики является наиболеепрогрессивным и этичным методом доклинических испытаний на живыхсистемах [62]. Разработанный экспериментальный подход позволил изучатьдействие БМККмоделированиинепосредственно на клетки, активированные in vivo приаутогемоперитонеума,перитонеальные-фибробластыимакрофаги и провести сравнительную оценку классических БМКК нифедипина,дилтиазема и верапамила в качестве регуляторов функции перитонеальныхфибробластов и макрофагов с определением дозозависимого эффекта.Проведенные исследования с использованием клеточных технологийпоказали, что пролиферативная активность фибробластов, полученных через 10суток после моделирования гемоперитонеума, в 5,3 раза превышала показатели неактивированных in vivo клетокконтрольных крыс.Рост митотическойактивности фибробластов сопровождался усилением их коллагенсинтетическойфункции, о чем свидетельствовало4-кратное увеличение образованиябелковосвязанного оксипролина - маркера коллагена, и, 3-кратным увеличениемсинтеза гиалуроновой кислоты, являющейся, наряду с коллагеном, одним изосновных компонентов межклеточного матрикса соединительной ткани.
При этомвыявленоналичиетеснойположительнойсвязимеждучисломсоединительнотканных спаек и изученными показателями: пролиферациейфибробластов, синтезом ими коллагена и гиалуроновой кислоты. Клеткимикроокружения активированных фибробластов (моноциты и макрофаги) такжедемонстрировали высокую пролиферативную и синтетическую активность.Моноциты, полученные от крыс на 10 сутки гемоперитонеума, проявляливысокуюспособностьктрансформациивмакрофаги,превышающуюконтрольные значения в 2,5 раза. Следствием активации макрофагов примоделировании асептического воспаления брюшины являлась усиленная секреция187ими цитокинов, прежде всего провоспалительного характера: TNF- и IL-1.Наиболеевыраженные(в19раз)отклоненияотуровняконтролярегистрировались при определении количества TNF-. Изменение уровня IL-1достигало 3,6-кратного увеличения. Это согласуется с имеющимися данными обиологических свойствах данных цитокинов, обдеструкцииирепарации,сопутствующихих участии в процессахвоспалению,способностииндуцировать пролиферацию фибробластов и синтез коллагена при активациифиброгенеза на этапах завершения воспаления [118, 240].
Сопоставлениерезультатов проведенных исследований на целостном организме (крысы,кролики) и в культуре клеток показали их однотипность и однонаправленность.Измененияфункций основных клеток соединительной ткани и клеток ихмикроокруженияврезультатеасептическоговоспалениябрюшиныпримоделировании гемоперитонеума с разрешением его в спайкообразованиехарактеризовались как in vivo, так и in vitro чрезмерной активацией фибробластови макрофагов, усиленной продукциейколлагена, гиалуроновой кислоты,провоспалительных цитокинов.Исследования по оценке дозозависимого эффекта регуляции активностиперитонеальных фибробластов и макрофагов БМКК верапамилом, дилтиаземом,нифедипином в культуре выявили, что введение верапамила в концентрациях0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 предотвращало чрезмерную активацию фибробластов:митотическая активность клеток снизилась на 33,3% и 58,5% соответственно отуровня активированных культур без лекарственных средств.
Верапамил такжеуменьшалгиперпродукциюколлагена:количествобелковосвязанногооксипролина в культуральной жидкости было снижено 52,8% - 67,7%,останавливал наработку гиалуроновой кислоты на уровне 61,3% - 75,0%. Степеньснижения количества данных веществ была более значима при концентрациипрепарата 0,0001 мл-1. Дозозависимый эффект, также более выраженный при0,0001 мл-1, обнаружен и при исследовании клеток микроокружения: степенитрансформации моноцитов в макрофаги, синтезе ими цитокинов TNF- и IL-1.188Выявление у БМККдилтиазема фармакологического эффекта порегуляции соединительной ткани при спайкообразовании показало, что данноелекарственное средство снижает чрезмерную функциональную активностьфибробластов и макрофагов в концентрации 0,0001 мл-1, но его нормализующеедействие менее выражено, чем у верапамила.
Добавление 0,0001 мл-1 дилтиаземав ростовую среду приводило к статистически значимому снижению уровнеймитозов фибробластов, макрофагальной трансформации моноцитов, коллагена игиалуроновой кислоты, TNF- и IL-1. При меньшей концентрации дилтиаземадостоверных различий с показателями в культуре без лекарственных средств побольшинству исследованных показателей не найдено. Нифедипин в исследуемыхконцентрациях не оказывал действия на культуру активированных фибробластови макрофагов, не влиял на синтез оксипролина и гиалуроновой кислоты, уровнипровоспалительных цитокинов.Особое внимание в настоящее время уделяется изучению процессов,происходящих в клетках на молекулярном уровне и включающих индукциютранскрипционныхфакторов,регулирующихпоследующуюактивациюитранскрипцию специфических генов регенерации. Нуклеарный (ядерный) факторNF-κB является одним из главных транскрипционных факторов, играющихважнуюрольвклеточнойпролиферации,апоптозе,воспалительнойиаутоиммунной реакциях, поскольку регулирует экспрессию генов, вовлеченных вэти процессы [76, 331, 515].
Нами проведен сравнительный анализ экспрессииNF-kB (р50/р65) в первичной культуре перитонеальных фибробластов крыс и вперевиваемой культуре дермальных фибробластов человека(Human DermalFibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience. Выявлено, что в культурах нестимулированныхперитонеальныхфибробластовчеловекаколичествоопределяемойконцентрациифибробластовNF-kB(150пг/мл).Внекрысипревышалоядерныхдермальныхминимальнойлизатахкультурактивированных клеток животных с гемоперитонеумом содержание NF-kB быловыше в 4,5 раза. При активации клеток в культуре дермальных фибробластовуровень NF-kB повышался в 4,8 раза.189При оценке влияния БМКК на активность ядерного фактора транскрипцииперитонеальных фибробластов крыс выявлено, что верапамил предотвращалчрезмерную активацию данного фактора: уровень NF-kB в ядерных лизатахкультур снизился при 0,00005 мл-1 верапамила на 15,8%, при 0,0001 мл-1 - на28,2%.
Добавление дилтиазема (0,0001 мл-1) в культуру клеток вызывало менеезначимое (на 15,1%), в сравнении с верапамилом, снижение активности NF-kB,при меньшей концентрации дилтиазем не оказывал нормализующего действия.Нифедипин не влиял на активность ядерного фактора транскрипции: содержаниеNF-κB в культурах с нифедипином и без добавления лекарственных средств,статистически не разнилось.
Введение верапамила в культуральную средудермальных фибробластов человека предотвращало активацию ядерного факторатранскрипции NF-kB останавливая его наработку в течении 24 часов инкубации с0,00005 мл-1 препарата на уровнепоказателейвкультуре87,5%,с 0,0001 мл-1 на уровне 57,0% отактивированныхфибробластовбездобавлениялекарственных средств. Дилтиазем и нефидипин не оказывали действия понормализацииэкспрессии NF-kB (р50/р65)в чрезмерно активированныхдермальных фибробластах человека.
Наличие у верапамила угнетающего влиянияна NF-kB фибробластов, как дермальных, так и перитонеальных, объясняет егоантипролиферативноедействиевотношениифибробластоввсоставесоединительнотканных образований различной локализации [361, 512, 523].Выраженная антицитокиновая, антианаболическая и антипролиферативнаяактивность классического недигидропиридинового БМКК верапамила позволилииспользовать именно его в качестве средства регуляции функции фибробластов сцелью снижения выраженности перитонеального спайкообразования.
При этомвыраженное кардио- либо ангиотропного действие верапамила минимизировалобы значимость изучаемого эффекта и делало бы проблематичным клиническоеиспользование выявленных закономерностей. Поэтому втрех сериях острыхопытов изучено влияние убывающих доз верапамила (0,4; 0,2; 0,1 мг/кг массытела животного) на системную кардио- и гемодинамику белых крыс приинтраперитонеальном введении препарата.190Внутрибрюшинное введение верапамила вживотногосопровождалосьотчетливымдозе 0,4 мг/кг массы телаотрицательнымхронотропнымикардиодепрессивным эффектами. Ангиотропное действие верапамила в этой дозереализовалось снижением ОПСС и падением АД.
Поэтому разовая дозаверапамила 0,4 мг/кг массы тела животного при внутрибрюшинном введениибыла признана избыточной для достижения задач эксперимента.Верапамил в разовой дозе 0,2 мг/кг массы тела животного привнутрибрюшинном введении также оказывал менее выраженное влияние накардио- и гемодинамику. Действие это сохранялось лишь в течение первых двухчасов эксперимента.
Однако наличиеи выраженность сердечнососудистыхэффектов верапамила в разовой дозе 0,2 мг/кг массы тела животного делалиданную дозу также избыточной для достижения поставленных задач.Лишь верапамил в разовой дозе 0,1 мг/кг массы тела животного привнутрибрюшинном введении не вызывал достоверных изменений показателейкардио- и гемодинамики, остававшихся стабильными в течение всего сроканаблюдения. На этом основании оптимальной для изучения влияния верапамилана процессы спайкообразования в брюшной полости при однократноминтраперитонеальном введении была принята доза 0,1 мг/кг массы телаживотного.Профилактическое внутрибрюшинное введение верапамила практическиполностью предотвращало образование перитонеальных спаек (до 0,220,04 наодно животное).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
