Автореферат (1152196), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Этот комплекс взаимодействует со стевиозидом, что приводит кобразованию третьего комплекса E-FSte и затем высвобождения FSte. В этой системе наряду среакцией трансфруктозилирования, протекает гидролиз сахарозы и фруктозил-стевиозида.Синтез фруктозил-стевиозида подавляется глюкозой и фруктозой. Концептуальная схема общегомеханизма реакции показана на рисунок 33.E-GluGluGluE-FRuSucEFruE-SucSucFruH2OFSteE-FruSteFSteFruGluE-FSteSteРисунок 33 - Концептуальная схема общего механизма реакции синтеза фруктозилстевиозида (Suzuki et al., 2002)73В наших экспериментах с целью трансфруктозилирования РебА, β-фруктофуранозидазуполучали из Arthrobacter sp.
K-1 (FERM BP-3192) (Япония), Arthrobacter sp. CICC 10137(Коллекция промышленных культур, Китай), Microbacterium saccharophilum NBRC 108778(Япония), Aspergillus niger IMI 303386 (Великобритания), Schwanniomyces occidentalis ATCC26077 (США), Aureobasidium pullulans DSM 2404 (ФРГ).Для этого раствор РебA (0,05 M; 0,48 г), сахарозы (2,0 M; 6,85 г) и b-фруктофуранозидазы(50 единиц на 1 г сахарозы) в 20 мл воды (pH 6,5-7,0) инкубировали при 40oC в течение 20 ч припостоянном перемешивании.Фермент инактивировали при 100oC в течении 10 мин, иреакционную смесь очищали на адсорбционной смоле Diaion HP-20, используя воду дляпромывкииэтанолдляэлюирования,аналогичновышеописанномувслучаесглюкозилированными производными.Наилучшие результаты по выходу фруктозилированного РебА получены со штаммомArthrobactеr sp. К-1, фермент которого гидролизовал моно-β-2,6-фуранозилированный вположении 19-O-глюкозильного остатка производную РебА (RebА-F) с достаточно высокимвыходом, т.е.
данная β-фруктофуранозидаза строго специфична к позиции С-19 (рисунок 34).Поэтому, все дальнейшие эксперименты проводили с применением данного фермента.Рисунок 34 - Трансфруктозилирование РебAВыход продукта реакции трансфруктозилирования зависит в значительной степени отконцентрации и соотношения акцептора, донора и фермента, а также от времени.Трансфруктозилирование проходит более эффективно при избытке сахарозы.
Выход монофруктозилированного производного составляет 70%, при условии количества компонентовреакции 0,5% РебA, 5% сахарозы и времени протекания реакции 17 часов.Дальнейшаяочисткаперекристаллизации из метанола.полученногокомпонентаосуществляетсяметодом744.1.Культивирование Arthrobacter sp. K-1Для получения β - фруктофуранозидазы использовали культуру Arthrobacter sp.
K-1.Культуру Arthrobacter sp. K-1 поддерживали на питательном агаре "Nissui", содержащий0,5% дрожжевого экстракта, 1,0 % полипептона и 0,5% NaCl (pH 7,0).Культивирование в глубинных условиях в колбах для получения инокулянта реализовалипри 30°C в течении 48 ч на жидкой питательной среде, содержащей 1,2% дрожжевого экстракта,0,8% полипептона, 4,0% лактозы, 0,4% (NH4)2HPO4 и 0,1% MgSO4х7H2O (pH 7,0).Культуральная жидкость в количестве 420 см3 переносили в 10 дм3 ферментёр спитательной средой.- 5,0% кукурузный экстракт,- 3,0% сахароза,- 0,4% (NH4)2HPO4,- 0,1% MgSO4х7H2O (pH 7,0)Культивирование осуществляли при 37°C в течении 24 ч, в условиях постоянной аэрации иконтроля pH в пределах 6,8-7,2 с помощью 2Н NaOH.Культуральную жидкость центрифугировали при 12,000 оборотах (20 мин, 4°C),отфильтровывали через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,45мм и сконцентрировали наультрафильтрах.
Концентрат внеклеточного фермента хранили при 4°C.β-Фруктофуранозидазную (ФФаза) активность определяли в КЖ и УФ по количествувосстанавливающих сахаров, освободившихся в результате гидролиза сахарозы.4.2. Влияние концентрации раствора и соотношение РебА и сахарозы навыход фруктозил-РебА (Fru-РебА)Раствор сахарозы в воде и фермент ФФаза инкубировали в присутствии различныхконцентраций РебA при 40оC. Количество фруктозил-РебA в реакционной смеси определялось спомощью ВЭЖХ. Результаты объединены в таблице 13.Таблица 13 - Влияние концентрации акцептора и времени реакции на формирование Fru-РебА(общая концентрация сухих веществ - 35%; 40оС; pH 6,5)Соотношение (вес/вес)РебАСахароза1213Время реакции,час244872244872Трансфруктозилирование, %фруктозил-РебА5,420,132,06,924,636,57514151617Таблица 13 - продолжение9,329,238,523,332,741,224,735,444,333,638,748,8244872244872244872244872Выход трансфруктозилирования существенно зависит от концентрации акцептора, донораи фермента, а также от времени реакции.
Получение фруктозил-РебA более эффективно приизбыточных количествах сахарозы. Так, если при массовом соотношении РебА к сахарозе 1:1степень трансфруктозилирования за 24 ч была всего 5,4%, то при соотношении 1:5, достигает добольше,чем23%.Степеньтрансфруктозилированиясущественноувеличиваетсяспродолжительностью реакции, как это показано для 24 ч, 48 ч и 72 ч (таблица 13 и рисунок 35).Степеньтрансфруктозилирования,%6024ч48ч72ч50403020100СоотношениеРебАкСахарозеРисунок 35 - Влияние соотношения сахарозы и РебА, а также времени на степеньтрансфруктозилирования76Выявлено,чтотрансфруктозилированиепротекаетболееэффективновконцентрированных растворах.
Чем выше общая концентрация сахарозы и РебА, тем большеТрансфруктозилирование,%отмакс.выход фруктозилированного РебА (рисунок 36).100908070605040302010051015202530404550Обшаяконцентрацияреакционнойсмеси,%Рисунок 36 – Влияние концентрации реакционной смеси на степень трансфруктозилирования(соотношение сахарозы к РебА = 10 : 1 в/в, 48 ч; 40C0)4.3. Влияние рH, температуры и количества ферментаС целью определения влияния рH на трансфруктозилирование, β-фруктофуранозидазуинкубировали с раствором 1%-ного РебА и 10%-ной сахарозы при 40оC в течении 15 ч приразличных рН. Выявлено, что реакция трансфруктозилирования наиболее эффективно протекаетТрансфруктозилирование, %от макс.в интервале рН 6,5-8,0 (рисунок 37).10090807060504030201004.555.566.577.588.5pHРисунок 37 - Влияние рH на трансфруктозилирование РебА с помощью β-фруктофуранозидазыиз Arthrobacter sp. K-177Для выявления наилучшей температуры, фермент инкубировали при различныхтемпературах с раствором 1%-ного РебA и 10%-ной сахарозы при рH 6,7 в течение 15 часов припостоянном перемешивании.
Реакция имеет четко выраженный температурный оптимум при40оС. Отклонение от этого приводит к резкому падению эффективности реакции (рисунок 38).Трансфруктозилирование, % от макс.10080604020030354045505560Температура, оСРисунок 38 - Влияние температуры на трансфруктозилирование РебА с помощью βфруктофуранозидазы из Arthrobacter sp. K-1Выявлено также, что с увеличением количества фермента происходит ускорение реакции.Наиболее оптимальным оказались количества 50-100 единиц на 1 г сахарозы (рисунок 39).Трансфруктозилирование, % от макс.100806040200102030405060708090100110Количество фермента, ед/г сахарозыРисунок 39 - Влияние количества β-фруктофуранозидазы на трансфруктозилирование РебА784.4.
Выделение и очистка фруктозилированного РебAРаствор 49 г РебА и 340 г сахарозы растворяли в 1 дм3 деионизированной воды, добавляли80 ед/г сахарозы β-фруктофуранозидазы и реакцию осуществляли при 40оС в течение 48 ч припостоянном перемешивании.Реакцию останавливали кипячением, охлаждали, добавляли ровный объем абсолютногоэтанола и осадок отделяли фильтрованием. Фильтрат обрабатывали активированным углем (1%)при 50-60оС в течение 20 мин для обесцвечивания. Этанол выпаривали и остаток очищали надвух колонках с макропористой смолой Diaion HP-20. Колонки последовательно промывали 10ю объемами воды и 10%-ным этанолом, и адсорбированные гликозиды элюировали 5-юобъемами 70%-ного метанола.
Метанол удаляли вакуум-выпариванием и содержание гликозидовпроверяли методом ВЭЖХ на колонке Zorbax-NH2 (4мм x 250 мм) при температуре колонки 40оСс использованием смеси ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 (объем/объем) в качествеподвижной фазы, скорости потока 1 мл/мин и DAD детектора, УФ (210 нм). Элюат из первойколонки представляет собой смесь основного количества не модифицированного РебА, в товремя как второй содержит более чем 80% фруктозил-РебА (рисунок 40).Рисунок 40 - ВЭЖХ-граммы элюатов из первой (А) и второй колонок (B)79Дальнейшуюочисткуфрукозил-РебАосуществляликристаллизациейиперекристаллизацией из минимального количества абсолютного метанола, в котором онпрактически нерастворим. Немодифицированный РебА остается в фильтрате, а чистота белыхкристаллов фруктозил-РебА достигает до 95% и более (рисунок 41).Рисунок 41 - ВЭЖХ-грамма фруктозил-РебА после перекристаллизации из абсолютногометанолаДля точной идентификации продуктов использовали масс-спектрометрический (MС)анализ в системе Agilent 6110 Series Quadrupole LC/MS с колонкой силикагель С18.Фруктозил-РебА, C44H70O23, b-2,6-фруктозилированный у 19-O-глюкозильной группы, иидентифицирован как b-D-фруктофуранозил-2,6-b-D-глюкопиранозильный эфир стевиол-13-Ob-D-глюкопиранозил-1,2-b-D-глюкопиранозил-1,3-b-D-глюгопиранозидамассой 1128 (рисунок 42).смолекулярной80Рисунок 42 - MSD анализ РебА (А) и фруктозил-РебА (B)81Улучшено качество вкусового профиля, послевкусия, горечи и приятности вкуса дляфруктозилированного РебA (Чхан, Мойсеяк, 2019б).
Полученные вкусовые характеристикисопоставимы с вкусовыми характеристиками аспартама и гораздо лучше, чем у РебА.Наблюдалось некоторое уменьшение горечи и улучшение вкусового профиля относительноРебА, однако послевкусие производного было несколько сильнее, чем у РебА. Интересно, чтовкусовые характеристики фруктозилированного стевиозида сопоставимы с таковыми аспартамаи превосходят РебА. Однако, фруктофуранозная связь не стабильна и может гидролизоваться вусловиях приготовления пищи.ГЛАВА 5. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ВКУСОВЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ ИСТРУКТУРОЙ ГЛИКОЗИДОВ СТЕВИИКачество и интенсивность сладости гликозидов стевии зависит от их строения и, вособенности, типа и количества углеводных единиц в их структуре, а также характера иконфигурации связей (Patent US WO 2017/106577, 2017).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
