Автореферат (1152196), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Трансглюкозилирование РебА ЦГТазойДля трансгликозилирования РебА с помощью ЦГТазы в качестве донора глюкозныхединиц использовали крахмал или g-циклодекстрин (g-ЦД) (Абелян, 2001; Abelyan 2009)Для выявления оптимального значения рН процесса с использованием крахмала, 10 гкрахмала суспендировали в 30 см3 буферного раствора с соответствующим рН и разжижениеосуществляли при 80-85°С в течение 20 мин после добавления 2 ед/г концентрированногоультрафильтрата культуральной жидкости Geobacillus stearothermophilus (2,0 единиц на 1 гкрахмала). В полученном растворе растворяли 10 г высокочистого РебА, добавляли 20 ед/гфермента и инкубировали при 55oC в течение 12 ч. Эффективность процесса оценивали поостаточному содержанию гликозидов.Для выявления оптимальных значений рН процесса с использованием ЦД, по 5,8 г g-ЦД ивысокочистого РебА растворяли в 85 см3 буферного раствора с соответствующим рН, добавлялифермент 8,5 ед/г РебA и инкубировали при 55oC течение 12 ч.Выявлено, что оптимальный рН для обоих процессов находится в пределах 5,5-7,0 (рисунок12).А,%отмакс.10080604020КрахмалЦД02345678рН9Рисунок 12 - Влияние рН на трансферазную активность ЦГТазы Geobacillus stearothermophilus(А, % от максимальной) при трансгликозилировании РебА.
рН 3,0-3,5 – ацетатныйбуфер; рН 4,0-6,5 –фосфатно-цитратный буфер; рН 7,0-9,0 –натрий-фосфатный буфер.Для определения оптимальной температуры трансгликозилирование осуществлялианалогично описанному методу для оптимального рН, при различных температурах.
рН45реакционной среды устанавливали 6,5. Оптимальная температура процесса находилась впределах 65-75°С, однако, чтобы обеспечить высокую стабильность ЦГТазы, 65оС была выбранав качестве оптимальной (рисунок 13) (Чхан, Мойсеяк, 2019а).100А,%отмакс.80604020КрахмалЦД03745505560657075808590Температура,оСРисунок 13 - Влияние температуры на степень трансгликозилирования РебА ЦГТазойGeobacillus stearothermophilus (А, % от максимальной)С увеличением количества биокатализатора повышалась степень трансферазной реакции.Однако суммарный выход моно- и ди-глюкозилированных производных, обладающихнаилучшими вкусовыми качествами, достигал своего максимума при использовании фермента вколичестве 8-9 ед.
ЦГТазы/г РебА (рисунок 14).А,%отмакс.10080604020КрахмалЦД002468101214ЦГТаза,ед./гРебАРисунок 14 - Суммарный выход моно- и ди-гликозилированных производных РебА (A, %)в зависимости от количества добавляемой ЦГТазы46Соотношениеиконцентрациясубстратовоказывалиопределенноевлияниенатрансглюкозилирование РебА. Для выявления наилучшего варианта, реакции осуществляли втечение 12 ч при 65оС с 24% раствором РебА и g-ЦД или крахмала в различных соотношенияхпри рН 6,5 с использованием 9 ед/г РебА ЦГТазы. С увеличением количества g-ЦД или крахмаласущественно увеличивается степень трансформации.
Однако, при этом падает степень сладостиполучаемого продукта, если ее измерить до его тонкой очистки. Вероятно, с коммерческой точкизрения соотношение компонентов 1:1 (в/в), приводящее к сладости продукта в пределах 120-130в условиях газированных напитков и 170-180 в кисломолочных и кондитерских продуктахявляется наиболее приемлемым (Чхан, Мойсеяк, 2019а). Хотя, конечно, все зависит от моделибизнеса и требования рынка, так как варьируя соотношение можно получить необходимый типА,%отмакссладости и в некоторых случаях решить проблему с наполнителями (рисунок 15).10090807060504030201000.5/1.01.0/1.01.0/2.0РебА/Крахмал1.0/3.01.0/4.0РебА/ЦДРисунок 15 - Степень трансгликозилирования (A, %) в зависимости от соотношения РебА идоноров глюкозных единиц3.1.2.
Трансгликозилирование РебА ЦГТазой и g-ЦД в качестве донораНа следующем этапе исследований проводили реакцию трансгликозилирования вприсутствии g-ЦД в соотношении 1:1 (в/в) осуществляли следующим образом.50 г g-ЦД растворили в 300 см3 воды, затем добавили 50 г РебА (≥ 97%) и нагрели дляполного растворения. Охлаждали до 65оC и добавили 25 см3 концентрированного фильтратакультуральной жидкости с ЦГТазной активностью. Реакцию осуществляли при 65оC в течении24-48 часов при постоянном перемешивании. Реакцию останавливали термообработкой при100оС в течение 10 мин, обрабатывали активированным углем (1%) при 70оС в течение 20 мин,уголь отделяли фильтрованием.Для осуществления реакции при массовом соотношении РебА:g-ЦД=1:2 и 1:3,использовали 24%-ную смесь 20 г g-ЦД и 10 г РебА и 30 г g-ЦД и 10 г РебА, соответственно.47Продуктом реакции является смесь немодифицированного РебА и его моно- (РебА-G1), ди(РебА-G2), три- (РебА-G3) и более гликозилированных производных (смесь РебА- Gly) (рис.
16)(Чхан, Мойсеяк, 2019а).(a)(b)(c)Рисунок 16 - ВЭЖХ-грамма исходной реакционной смеси при 1:1 (a); 1:2 (b) и 1:3 (c) массовомсоотношении РебА и g-ЦД через 48 ч реакцииВыявлено,чтоприповышенныхконцентрацияхЦДувеличиваетсястепеньтрансгликозилирования и снижается количество нетрансформированного РебА. Так, если присоотношении РебА:g-ЦД=1:1 (в/в), через 48 часов реакции количество остаточного РебАсоставляет 17,14%, то при 1:2 (в/в) и 1:3 (в/в) – 8,15% и 6,5%, соответственно. Однако, сувеличениемпродолжительностиреакции,суммарноеколичествомоно-иди-48гликозилированных производных падает с одновременным повышением производных с болеедлинными боковыми цепочками.
Так, если при соотношении РебА:g-ЦД=1:2 (в/в), через 24 часовреакции их количество составляет 29,48%, а при 1:3 (в/в) – 34,25%, то через 48 реакции суммасоставляет 27,92% и 26,6%, соответственно (таблица 4 и рисунок 17) (Abelyan, 2009; Чхан,Мойсеяк, 2019а).Таблица 4 - Соотношение гликозилированных производных РебА с ЦГТазой сиспользованием g-ЦД в качестве донора глюкозных единицПродуктыРебАРебA-G1РебA-G2РебA-G3РебA-G4РебA-G5РебA-G6РебA-G7РебA-G8РебA-G9РебA-G10РебA-G11РебA-G12РебA-G13РебA-G14РебA-G15-G19РебА:g-ЦД(1:1, в/в)48 ч17,1421,5719,3814,619,686,134,292,421,791,110,800,430,65Количество производных, %РебА:g-ЦД (1:2)РебА:g-ЦД (1:3)(в/в)(в/в)24 ч48 ч24 ч48 ч12,288,157,846,5014,9614,0218,2214,6014,5213,9016,0312,0013,6213,3812,2510,6711,3013,4010,4310,739,2511,719,339,506,777,856,806,735,135,865,856,313,903,434,384,753,302,823,654,242,142,042,522,961,721,811,702,541,111,631,001,861,761,273,5849(а)(б)Рисунок 17 - ВЭЖХ-грамма исходной реакционной смеси при 1:2 (a) и 1:3 (б) массовомсоотношении РебА и g-ЦД через 24 часов реакцииКак и следовало ожидать из теории, эффективность трансглюкозилирования повышаласьпропорционально увеличению общей концентрации субстратов, как это показано на рисунке 18.A,%807060504030201000Рисунок1851520253035B,%- Влияние общей концентрации субстратов (В, %) на степеньтрансгликозилирования (А, % от максимальной) при соотношении РебА к gЦД 1:1 (в/в), 65оС через 24 часов реакцииОбработанный активированным углем раствор реакционной смеси смешивали с этаноломдо его 10%-ой концентрации и пропускали через колонку с Diaion HP-20 или Amberlite XAD-4,50соотношение гликозидов к гелю составляет 10% (вес/объем).
Колонку последовательнопромывали тремя объемами дистиллированной воды и 10%-ого этанола для удалениянеадсорбированных веществ. Элюцию трансглюкозилированных продуктов проводили пятьюобъемами 50%-ного этилового спирта, растворы выпаривали и остаток высушивали досуха при45-50оС под вакуумом.С целью повышения количества моно-, ди- и три-глюкозилированных производных, чтосделает задачу их выделения, очистки и получения в гомогенном состоянии, полученныйпродукт обрабатывали b-амилазой или глюкоамилазой.
Такая обработка приводит к гидролизудлинных боковых цепочек производных до моно- и ди-глюкозилированных компонентов(рисунок 19).Обработку b-амилазой может производиться либо до очистки трансглюкозилированнойсмеси на крупнопористых адсорбционных смолах, либо после хроматографического удаленияостаточных мальтоолигосахаридов и присутствующих в реакционной смеси других примесей.К 50 г исходного продукта добавляли 10 ед/г b-амилазы (Nagase, Япония), разбавленную в10 раз, и инкубировали при 40оC в течении 2-3-х часов. Количество фермента и время обработкиможно менять в соответствии с преследуемой целью, что будет влиять на соотношениеотдельных производных в конечной смеси. Продукт очищали на специфической крупнопористойхроматографической смоле Diaion HP-20, как это описано выше для исходной реакционнойсмеси (рисунок 19).(а)51(б)Рисунок 19 - ВЭЖХ-граммы трансглюкозилированного РебА в присутствии ЦД до (а) и послеобработки b-амилазой (б).Продукт содержит немодифицированный РебА и от моно- до пента-глюкозилированныепроизводные в соотношении, приведенные в таблице 5.Таблица 5 - Соотношение гликозилированных производных РебА до и после обработки bамилазойПродуктыРебАРебA-G1РебA-G2РебA-G3РебA-G4РебA-G5РебA-G6РебA-G7РебA-G8РебA-G9РебA-G10РебA-G11РебA-G12Количество производных, %РебА:g-ЦД (1:3)РебА:g-ЦД (1:3)(в/в); 24 ч(в/в); 24 ч; после b-амилазы7,8417,0818,2230,5116,0331,2612,2515,5310,434,579,331,046,805,854,383,652,521,701,00Процессуальная схема трансглюкозилирования с использованием g-ЦД в качестве донораглюкозных единиц приведена на рисунок 20.52Рисунок 20 - Упрощенная схема трансглюкозилирования гликозидов ферментом ЦГТазой сиспользованием ЦД в качестве донора533.1.3.
Трансгликозилирование РебА ЦГТазой и крахмалом в качестведонораДля осуществления трансгликозилирования РебА в присутствии крахмала, крахмалсуспендировали в трех объемах (вес/объем) деионизированной воды с рН 6,0-6,5, добавлялиЦГТазу в количестве 2,0 ед/г крахмала и смесь постепенно нагревали при постоянномперемешивании до 75-80оС, до получения однородной разжиженной массы крахмала сдекстрозным эквивалентом (ДЭ) в пределах 0,15-0,3. Раствор охлаждали до 60-65оС, добавлялиРебА в количестве 1:1 (в/в) и перемешивали до полного растворения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
